Fas与FasL在兔视网膜缺血再灌注损伤中的表达及rh-bFGF对其表达的影响

2016-05-11 08:25邵宏超葛嫣然
蚌埠医学院学报 2016年1期
关键词:神经节纤维细胞生长因子

邵宏超,葛嫣然,刘 岩,苏 杰



Fas与FasL在兔视网膜缺血再灌注损伤中的表达及rh-bFGF对其表达的影响

邵宏超,葛嫣然,刘岩,苏杰

[摘要]目的:探讨重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)对兔视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)的保护作用。方法:应用前房加压灌注法,升高眼内压,造兔视网膜RIRI模型。外眼及眼底正常纯种大耳白兔66只,随机分为正常假手术组(6只)、RIRI组(30只)和RIRI + rh-bFGF组(30只),均选取右眼为实验眼。RIRI组和RIRI + rh-bFGF组在建立RIRI模型后,前者给予0.9%氯化钠注射液,后者给予rh-bFGF药物治疗。常规HE染色观察视网膜组织细胞形态学的变化,免疫组织化学法检测RIRI组和RIRI + rh-bFGF组6、12、24、48、72 h 5个时间点视网膜组织中Fas、FasL蛋白的表达变化。结果:正常假手术组兔视网膜未见凋亡细胞; RIRI组视网膜的内核层和神经节细胞层可见凋亡细胞,且细胞凋亡在24 h达到高峰。Fas在正常假手术组视网膜组织中未见明显表达;其他2组RIRI后6 h开始有少量表达,至24 h时达到高峰,随后48 h开始下降,到72 h后明显减弱。FasL在正常假手术组视网膜组织中未见明显表达;其他2组RIRI后12 h表达开始升高,至24 h达到高峰,之后略有下降,至72 h依旧可见较高水平表达。RIRI + rh-bFGF组与RIRI组相比较,各时间点凋亡因子阳性表达趋势大致相同,且Fas、FasL表达均明显减弱(P<0.01),2组在6、12、24、48 h各时间点表达差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:rh-bFGF对兔RIRI保护作用机制可能与抑制视网膜内Fas、FasL表达有关。

[关键词]再灌注损伤;视网膜;重组人碱性成纤维细胞生长因子;兔

[作者单位]河北联合大学附属医院眼科,河北唐山063000

缺血性视网膜在恢复血供后,视力未出现提升反而进一步下降,这种视功能损伤是不可逆的,临床上称之为视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)[1]。RIRI作为一个很常见的病理生理损伤过程,其损害机制是多方面的[2],其中凋亡作为细胞死亡的主要形式之一备受关注,而Fas/FasL系统被认为是凋亡的重要机制之一[3]。重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)是利用基因工程技术,在大肠埃希菌中表达、纯化而获得的一种细胞因子,具有诱导新生血管生成、组织损伤修复、保护并刺激神经元再生等作用[4-5]。本实验应用前房灌注的方法,建立实验动物RIRI模型,并行玻璃体腔内给药rh-bFGF,观察RIRI后rh-bFGF对Fas和FasL表达的影响,并进一步讨论rh-bFGF对RIRI保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1材料选择66只雄性体健大耳白兔(我院动物中心购入),外眼及眼底正常,体质量(2.2±0.2) kg。于相同生长环境饲养。主要试剂: rh-bFGF分装试剂(上海西塘生物科技有限公司),Fas单克隆抗体和FasL单克隆抗体(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组将纳入实验的动物随机分为正常假手术组(6只)、RIRI组(30只)和RIRI + rhbFGF组(30只)。其中正常假手术组仅给予前房穿刺操作,不行其他特殊处置。RIRI组和RIRI + rhbFGF组按照缺血再灌注(RIR)后不同时间段,各自分为6、12、24、48、72 h组,且均选取右眼为实验眼。1.2.2建立RIRI模型RIRI组和RIRI + rh-bFGF组同时制备RIRI模型。RIRI + rh-bFGF组在建立RIRI模型初始时玻璃体内注入相当于2 μg的rh-bFGF溶液,与此同时向RIRI组玻璃体腔内注入等体积0.9%氯化钠注射液。RIRI模型的建立采取前房加压灌注法:兔耳缘静脉给予1 g/L的乌拉坦5 mg/kg注射麻醉,同时兔眼滴0.4%奥布卡因行表麻。麻醉满意后固定于兔台上,呈俯卧位,均选取右眼造模,RIRI组和RIRI + rh-bFGF组给予散瞳,将连接0.9%氯化钠注射液的5号头皮针从耳前方角巩膜缘内刺入前房,缓慢升高输液瓶高度产生16.7 kPa压力(125.25 mmHg,即170.30 cmH2O)[6]。视网膜中央动脉血供中断标准:球结膜、虹膜颜色变苍白,视网膜明显水肿且呈苍白色。前房灌注维持60 min,后缓慢降低输液瓶高度至动物眼水平,此时球结膜动脉血流恢复,虹膜颜色恢复正常,视网膜血供恢复橘红色,RIRI模型造模成功[7]。正常假手术组散瞳后,仅行前房穿刺操作,不做其他特殊处理。1.2.3取材、固定和切片正常假手术组动物6只处死并摘除眼球,其他2组根据不同的RIR时间,分别于损伤后5个时间点处死动物并摘除眼球。眼球标本制作石蜡切片后给予HE及免疫组织化学染色。

1.2.4 HE染色观察视网膜组织病理变化烘干切片,脱蜡,乙醇复水,每个体积浓度2 min。苏木素染色,0.5%盐酸乙醇分化,1%氨水泛蓝,1%伊红染色,之后乙醇脱水,各体积浓度2 min,二甲苯透明,中性树胶封片。光学显微镜下观察兔视网膜各层组织结构的变化。

1.2.5免疫组织化学SABC法测定Fas和FasL

切片常规脱蜡后热修复抗原,然后加入H2O2灭活内源性酶,再加入山羊血清封闭液封闭。之后顺次加入一抗、生物素化二抗,滴加试剂SABC,DAB显色,苏木素轻度复染,脱水,透明,封片。显微镜下观察。每只眼球随机取4张切片,每张切片随机取4个视野,由各视野的阳性细胞数算出平均值,进行统计学分析。

1.3统计学方法采用方差分析和q检验及t检验。

2 结果

2.1兔RIRI后组织病理学变化显微镜下观察正常兔视网膜,视网膜的层次分明,结构规整,视细胞层、双极细胞层、神经节细胞层(RGC)的细胞核平行排列,RGC呈卵圆形,为单层排列,位于内界膜外侧,无空泡变性;内核层与外核层的细胞有多层细胞核,每一层细胞核之间呈排紧密、规则排列,与内、外丛状层分界清楚。RIRI后,可见视网膜出现明显水肿,视网膜各层细胞排列疏松,细胞之间空隙增大,同时发现RGC和内核层细胞出现空泡样变性,神经节细胞的数目较前减少,内核层细胞数也出现下降,神经纤维层和内丛状层出现肿胀,且较正常组织有所增厚,细胞层次排列紊乱伴大量丢失。RIRI + rhbFGF组各层组织损害有着与RIRI组相同的变化趋势,但各层视网膜细胞损害程度、细胞丢失数量均较RIRI组为轻(见图1、2)。

2.2兔视网膜组织中Fas蛋白和FasL蛋白的表达

2.2.1 Fas蛋白的表达Fas蛋白几乎不在正常假手术组的视网膜中表达。RIRI组中RIR后6 h,视网膜神经节细胞层和神经纤维层可发现存在Fas蛋白,且主要为细胞质和细胞膜染色; RIR后12 h时Fas蛋白在各层表达逐渐增多; RIR后24 h可见深棕色的细胞膜及细胞质染色细胞分布在视网膜RGC、内丛状层、内核层及神经纤维层,Fas蛋白的表达达到高峰; RIR后48~72 h,Fas蛋白的阳性表达逐渐减少,较之正常组偏高。RIRI + rh-bFGF组在6、12、24、48 h各时间点Fas蛋白阳性表达均较RIRI组明显减少(P<0.01),RIRI组和RIRI + rhbFGF组表达结果在6、12、24、48 h各时间点差异均有统计学意义(P<0.01) (见表1、图3~6)。

2.2.2 FasL蛋白的表达FasL蛋白几乎不在正常假手术组的视网膜中表达。RIRI组中RIR后6 h,视网膜神经节细胞层和神经纤维层可发现存在FasL蛋白,RIR后12 h FasL蛋白表达逐渐上升,RIR后24 h可见深棕色的细胞膜及细胞质染色细胞分布在视网膜RGC、内丛状层、内核层及神经纤维层,FasL蛋白的表达达到高峰; RIR后48~72 h,其表达缓慢下调。RIRI + rh-bFGF组在6、12、24、48 h各时间点FasL蛋白阳性表达较RIRI组均明显减少(P<0.01),RIRI组和RIRI + rh-bFGF组表达结果在6、12、24、48 h各时间点差异均有统计学意义(P<0.01) (见表2、图7~10)。

表1 RIRI组和RIRI + rh-bFGF组不同时间点视网膜神经节细胞Fas表达细胞数(ni=6;±s)

表1 RIRI组和RIRI + rh-bFGF组不同时间点视网膜神经节细胞Fas表达细胞数(ni=6;±s)

q检验:与6 h比较**P<0.01;与12 h比较△△P<0.01;与24 h比较##P<0.01;与48 h比较+ + P<0.01

分组 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P  MS组内1 333.45  <0.01  756.302 RIRI + rh-bFGF组 155.2±11.2 358.3±20.3**894.6±19.1**△△585.4±6.9**△△##75.1±7.6**△△## + + 3 314.10  <0.01  201.542 t 3.50 9.97 9.14 8.33 2.21  —  —  —P <0.01  <0.01  <0.01  <0.01  >0.05 RIRI组 179.6±12.9 463.8±16.1**1 119.6±57.2**△△612.7±4.1**△△##85.2±8.2**△△## + +———

表2 RIRI组和RIRI + rh-bFGF组不同时间点视网膜神经节细胞FasL表达细胞数(ni=6;±s)

表2 RIRI组和RIRI + rh-bFGF组不同时间点视网膜神经节细胞FasL表达细胞数(ni=6;±s)

q检验:与6 h比较**P<0.01;与12 h比较△△P<0.01;与24 h比较##P<0.01;与48 h比较+ + P<0.01

分组 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h F P  MS组内4 327.24<0.01 217.668 RIRI + rh-bFGF组 53.3±0.8  354.5±6.8**890.5±15.9**△△ 633.2±21.9**△△##170.1±15.6**△△## + + 3 432.47<0.01 204.532 t 4.32 6.21 10.31 11.22 1.66  —  —  —P <0.01  <0.01  <0.01  <0.01  >0.05 RIRI组 55.7±1.1  379.6±7.2**998.7±20.2**△△ 766.3±19.1**△△##185.3±16.2**△△## + +——

3 讨论

临床上视网膜急性缺血性疾病经治疗后,视网膜细胞在缺血损伤后再次进行再灌注,之后不仅未能挽救视功能,反而会加重视功能的损害,引起视网膜的损伤,并进一步导致细胞的死亡。因此,进一步讨论RIRI的发病机制以及便捷、高效的治疗方法对临床治疗此类疾病是非常重要的。

目前已有研究[8]证明,凋亡是RIRI中神经细胞丧失的重要途径之一。细胞凋亡是个复杂的过程,同时受许多基因调控,Fas/FasL系统为主的膜受体死亡通路在这个过程中起着非常重要的作用。Fas蛋白作为一种膜受体蛋白存在于细胞表面,它是神经生长因子受体/肿瘤坏死因子受体超家族的成员之一,FasL作为细胞表面分子从属于肿瘤坏死因子家族,它主要由T淋巴细胞表达,同时也是Fas蛋白配体。当FasL与表达Fas的细胞结合后,可诱导其凋亡[9]。正常视网膜组织中二者表达极低[10]。本实验中应用免疫组织化学法发现,在RIR后6 h,可检测到Fas的表达,RIR后24 h,Fas的表达达到高峰,之后逐渐减少;在RIR后12 h,视网膜组织中可检测到FasL的表达,至24 h达到顶峰,之后表达逐渐下调,至72 h依旧保持较高的水平。由此我们发现,Fas和FasL的表达顶峰与细胞凋亡的顶峰维持一致; Fas和FasL蛋白强阳性部位与RGC凋亡发生部位保持一致,由此推测视网膜神经节细胞的凋亡可能是二者的过表达导致。

rh-bFGF属于成纤维细胞生长因子家族,拥有多种生物学活性[11],可直接刺激成纤维细胞和细胞外基质蛋白质的有效结合,形成胶原纤维; rh-bFGF还可与相应受体结合后,诱导内皮细胞迁移,促进毛细血管的增生,形成胶原纤维[12];同时rh-bFGF可使血管细胞迅速增殖,改善局部微循环和组织的营养状况[13]。本实验通过建立RIRI模型,应用rh-bFGF玻璃体腔注射,发现视网膜组织在水肿程度、空泡变形和核固缩方面与RIRI组相比均有不同程度的改善,凋亡基因Fas、FasL蛋白的阳性表达率也较RIRI组下降。由此我们推论,视网膜RIRI后给予玻璃体腔内注入rh-bFGF,可下调凋亡基因Fas、FasL蛋白的阳性表达,从而减少神经细胞凋亡数量,这可能是rh-bFGF治疗RIRI的作用机制之一。本实验结果提示,rh-bFGF对RIRI有一定的保护作用,为在临床上应用rh-bFGF治疗RIRI疾病开阔了思路。

[参考文献]

[1]WANG XD,KASHII S,ZHAO L,et al.Vitam in B6 protects primate retinal neurons from ischemic injury[J].Brain Res,2002,940(1/2) : 36.

[2]赵成,游志鹏.视网膜缺血再灌注损伤的治疗进展[J].国际眼科杂志,2007,7(2) : 475.

[3]KMI HS,PARK CK.Retinal ganglion cell death is delayed by activation of retinal intrinsic cell survival program[J].Brain Res,2005,1057(1/2) : 17.

[4]曾环想,张宏波,黄凯,等.碱性成纤维细胞生长因子的药学研究进展[J].中国新药杂志,2010,11(19) : 949.

[5]王小兵,王晓健,张宝林.不同浓度的重组人碱性成纤维细胞生长因子对离体人表皮细胞增殖的影响[J].中国药物与临床,2008,8(12) : 969.

[6]FOULDS WS,JOHNSON NF.Rabbit electroretinogram during recovery from induced ischaemia[J].Trans Ophthalmol Soc UK,1974,94(2) : 383.

[7]刘朋朋,张琦.外源性H2S预处理对大鼠RIRI细胞凋亡的影响[J].国际眼科杂志,2012,12(1) : 33.

[8]MIYAKI K,MATSUBARA A,NISHIWAKI A,et al.Pitavastatin attenuates leukocyte-endothelial interactions induced by ischemiareperfusion injury in the rat retina[J].Curr Eye Res,2009,34 (1) : 10.

[9]NAGATA S,GOLSTEIN P.The Fas death factor[J].Science,1995,267(5203) : 1449.

[10]GRIFFITH TS,BRUNNER T,FLETCHER SM,et al.Fas ligandinduced apoptosis as a mechanism of immune privilege[J].Science,1995,270(5239) : 1189.

[11]刘索新,鞠学红.神经营养因子对视网膜缺血再灌注损伤的影响[J].解剖科学进展,2013,19(5) : 454.

[12]孟根托娅,闫元奎,赵海霞.实验性视网膜脱离时外源性bFGF对视网膜细胞凋亡的干预作用[J].中国实用眼科杂志,2009,27(9) : 1055.

[13]王彩荣,王超英.碱性成纤维细胞生长因子在眼科的研究与应用[J].临床误诊误治,2009,22(5) : 73.

(本文编辑刘畅)

·大学生科技园地·

The expressions of Fas and FasL in rabbit retina with ischemia-reperfusion injury,and the effect of recombinant human basic fibroblast growth factor on its expression

SHAO Hong-chao,GE Yan-ran,LIU Yan,SU Jie
(Department of Ophthalmology,The Affiliated Hospital of Hebei Union University,Tangshan Hebei 063000,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protective effects of recombinant human basic fibroblast growth factor(rh-bFGF) on retinal ischemia-reperfusion injury(RIRI) in rabbit.Methods: The models of RIRI in rabbit were established by elevating intraocular pressure.Sixty-six healthy rabbits with normal external ocular and fundus were randomly divided into the sham-operation group(6 rabbits),retinal ischemia-reperfusion injury group(RIRI group,30 rabbits) and rh-bFGF treatment group(RIRI + rh-bFGF group,30 rabbits).The right eye was selected as the experimental eye.RIRI group and RIRI + rh-bFGF group were treated with 0.9% sodium chloride injection and rh-bFGF,respectively.Morphological changes of retinal cells and the expressions of Fas and FasL of retinal tissue in sham-operation group,and at 6 h,12 h,24 h,48 h and 72 h time-points of RIRI and RIRI + rh-bFGF groups were detected by HE staining and immunohistochemical method,respectively.Results: No apoptotic cells was found in sham-operation group.Apoptotic cells in RIRI group located mainly in the inner nuclear layer and the ganglion cell layer,and which arrived at peak at 24 h after reperfusion.No obvious expression of Fas in retinal tissue of the sham-operation group was found.After RIRI,little Fas expressing at 6 h,arriving at peak at 24 h,then begaining to decrease at 48 h and significant weakening at 72 h were found.No obvious expression of FasL in retinal tissue of the sham-operation group was found.After RIRI,FasL expression beginning to increase at 12 h,arriving at peak at 24 h,then beginning to decrease and still maintaining a high level at 72 h were found.Compared with the RIRI group,the positive expression trend of apoptotic factors at each time-point in RIRI + rh-bFGF group was similar,the expressions of Fas and FasL in RIRI group and RIRI + rh-bFGF group obviously decreased(P<0.05).The differences of the expression of Fas and FasL at 6 h,12 h,24 h,48 h and 72 h between RIRI and RIRI + rh-bFGF group were statistical significance(P<0.01).Conclusions: The protective mechanism of rh-bFGF on RIRI in rabbit may be related to inhibit the expressions of Fas and FasL in retina.

[Key words]reperfusion injury; retina; recombinant human basic fibroblast growth factor; rabbit

[作者简介]邵宏超(1981-),女,硕士研究生,主治医师.

[基金项目]河北省唐山市科技计划项目(12140209A-45)

[收稿日期]2015-04-30

[文章编号]1000-2200(2016) 01-0020-04

[中图法分类号]R 619.9; R 322.91

[文献标志码]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.01.005

猜你喜欢
神经节纤维细胞生长因子
奇神经节介入治疗的应用进展
基于对背根神经节中神经生长因子的调控探究华蟾素治疗骨癌痛的机制
电针“梨状二穴”对腰椎间盘突出症大鼠NPY、SP及神经节的影响
探讨浓缩生长因子(CGF)在糖尿病足溃疡创面治疗中对溃疡创面愈合的作用
过氧化氢体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞氧化损伤模型的构建和分析
眼部成纤维细胞在眼科疾病中的研究进展△
用生长因子美容险毁容
滇南小耳猪胆道成纤维细胞的培养鉴定
弥漫性轴索损伤患者应用高压氧与神经节苷脂联合治疗的效果研究
成纤维细胞在皮肤创伤修复中的作用研究进展