siRNA介导的FOXA2基因沉默对乙肝病毒复制的影响

张岩明　戎秀格　李广平

[摘 要] 目的：探讨小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）介导的FOXA2基因沉默对乙肝病毒（HBV）复制的影响。方法：设计靶向FOXA2基因siRNA序列，构建质粒转染HuH-7人肝癌细胞。用QT-PCR和 RT-PCR 检测细胞FOXA2基因mRNA变化；用Western blot检测细胞FOXA2蛋白变化；用Northern blot分析FOXA2基因沉默后HBV RNA表达。结果：构建FOXA2基因稳定沉默的F-S细胞株，FOXA2基因与蛋白沉降效率明显。FOXA2基因沉默后，HBV病毒3.5kbRNA升高，FOXA2抑制HBV病毒的复制。结论：FOXA2基因通过降低3.5kbRNA的表达抑制乙肝病毒的复制。

[关键词] siRNA；FOXA2；乙肝病毒

中图分类号：R575.1 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）02-052-03

DOI：10.11876/mimt201602019

乙肝病毒（HBV）引起的传染性疾病。HBV是双链环形结构[1]，3.5kbRNA包含C（核抗原）/P（DNA多聚酶）/S（表面抗原）/X（X蛋白），是HBV进行复制的关键因子。FOXA[2-3]是核转录因子，由FOXA1、FOXA2、FOXA3构成。FOXA是肝转录因子之一，在肝器官的形成和发展及肝进行新陈代谢过程中发挥重要作用。FOXA也是HBV复制的关键调控点，因为HBV病毒所有的启动子和增强子均包含FOXA结合位点。大量实验表明HBV转基因鼠中转入FOXA2，HBV复制降低，进而推断FOXA2可以抑制HBV的复制。因此我们设计靶向FOXA2的siRNA序列，构建质粒转染人肝癌细胞HuH-7，观察FOXA2基因沉默后对乙肝病毒复制的影响。

1 材料

质粒载体（上海吉凯基因公司）；jetPRIME Transfection Reagent （Polyplus ）；Trizol（Invitrogen）；核酸提取试剂盒（庄盟国际生物基因公司）；Maxima SYBR Green QT-PCR Master Mixes（Thermo Fisher Scientific company）；HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit （北京康为世纪生物公司）；Golden view（庄盟国际生物基因公司）；β-Actin单克隆抗体（Cell Signaling company ）；FOXA2抗体（Abcam company）；miRNA Northern blot reagent （TAKARA company）；ECL显色试剂盒（Thermo Fisher Scientific company ）。

2 方法

2.1 细胞培养

HuH-7细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO2 条件下孵育箱内培养。EDTA胰酶消化HuH-7细胞，取对数生长期细胞实验。

2.2 细胞转染及筛选

将1.5×105 HuH-7细胞接种于6孔板中，37℃、5% CO2 孵育箱中过夜。待HuH-7细胞贴壁覆盖率70%～80%时，换新培养液，将含FOXA2-siRNA的质粒与jetPRIME转染试剂按1：2混合滴加到6孔板1、2、3孔细胞上。同时将不含靶序列空质粒与jetPRIME转染试剂按照同样比例滴加到6孔板4、5孔细胞上。第6孔为阴性对照只加培养液（阴性组）。转染3周后挑取单克隆进行鉴定。将FOXA2基因沉默细胞株命名为F-S细胞株；空质粒细胞株命名为K-S细胞株。提取F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞基因和蛋白，用QT-PCR、RT-PCR及Western blot对siRNA介导FOXA2基因沉默进行验证。

2.3 QT-PCR、RT-PCR 法检测FOXA2基因mRNA

表达

用Trizol试剂1mL分别裂解F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞株；加入0.2mL氯仿，颠倒混匀待两液相分层后离心，取上清液至新EP管中；加与上清液等体积异丙醇混匀，室温放置20min，离心弃上清；加入无水乙醇离心弃上清液并风干；加入30μL RNAase-free ddH2O，反复吹打混匀，获得细胞总RNA，经反转体系得到cDNA。QT-PCR条件：底物液12μL，H2O7.5μL，引物（FOXA2、Actin）2μL，模板2μL。RT-PCR对FOXA2基因引物进行扩增，条件如下：98℃ 10s，60℃30s，72℃30s，32个循环。RT-PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪显示，以ActinPCR扩增作为内参对照。

2.4 Western blot检测FOXA2蛋白变化

用蛋白抽提试剂分别提取F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞株总蛋白，测定蛋白浓度，用Western blot检测FOXA2蛋白表达。具体步骤：配置分离胶和浓缩胶，蛋白上样，SDS-PAGE 80V电泳3h后转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂奶封闭，抗FOXA2抗体（1：500）4℃过夜，二抗（1：2000）37℃孵育1h，ECL试剂盒化学发光后曝光成像，同时检测Actin（1：500）表达作为内参对照。

2.5 Northern blot 檢测 HBV RNA 表达

用 Trizol 法分别提取F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞RNA。电泳：配置15%尿素变性PAGE胶，将样品与RNA loading按比例混合，70℃5min，立即置于冰上，上样恒压80V电泳；转膜：组装转膜结构滤纸、胶、膜、滤纸，恒压60V转膜1h；杂交：将膜放入杂交管中，加入杂交缓冲液42℃旋转震荡30min ，弃液加入杂交缓冲液+mRNA探针42℃旋转震荡30min，弃液加入杂交缓冲液+探针信号扩增素42℃旋转震荡2h；信号检测：将膜放入显色盒中，封闭30min，加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素40min，加入化学试剂曝光成像。

3 结果

3.1 F-S细胞株 FOXA2基因mRNA水平变化

3.1.1 QT-PCR法检测F-S细胞株沉默效率 图1a为FOXA2基因在F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7細胞中定量表达。对比HuH-7细胞与K-S细胞发现，空质粒基因对沉默效率影响不大，表明其在基因水平对沉默效率影响不显著，而F-S细胞FOXA2基因沉默效率为89%，与K-S细胞相比有显著性差异（P<0.05）。为了进一步验证沉默细胞株稳定性，我们将F-S细胞接种到培养瓶中，每隔3d收集细胞，提取总RNA，用QT-PCR法检测F-S细胞FOXA2基因表达。由图1b得知，经过15次传代，F-S细胞FOXA2基因沉默效率在80%～93%之间波动（P<0.05），显示其沉默效果稳定。

3.1.2 RT-PCR法检测F-S细胞株FOXA2基因表达 将F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞株分别提取总RNA，反转录成cDNA后，应用RT-PCR法检测FOXA2基因表达。与HuH-7细胞相比，F-S细胞中FOXA2基因表达明显降低（见图2）。

3.2 Western blot 检测F-S细胞株FOXA2蛋白水平变化

3.3 Northern blot 检测 HBV RNA 表达情况

4 讨论

慢性乙型肝炎[4-5]是我国最常见传染病之一。1992年中国乙型肝炎表面抗原（HBeAg）携带者为9.75%，因此中国属于乙肝病毒高流行区。自从2002年乙肝疫苗纳入计划免疫以来，乙肝感染率已下降为7.18%，与1992年相比，乙肝感染者已减少3000万。然而乙肝病毒携带者，尤其是在幼年[6]感染乙肝病毒患者，30%左右会发展成为慢性乙肝，甚至是肝硬化或者肝癌。因此研究乙型肝炎分子机制变得尤为重要。

siRNA[7]作为一种新基因阻断技术，具有高效、特异、低毒性等优点，目前已用于自身免疫性疾病、病毒感染、乙型肝炎 、癌症等多种疾病研究中。在体外合成双链RNA（doubles stranded RNA，dsRNA）由质粒导入细胞，核酸酶Ⅲ-Dier将其处理为21～23个碱基小干扰RNA（small interferencing RNA，siRNA）。siRNA与解螺旋酶、核酸酶等结合形成RNA诱导沉默复合物（RNA inducing silencing complex，RISC），然后与靶基因互补mRNA结合，将mRNA降解。

本次实验我们用siRNA技术在HuH-7细胞中诱导FOXA2[8-10]基因沉默。从实验结果来看，FOXA2基因在mRNA水平和蛋白水平都有明显下降。多次实验重复验证，结果均是FOXA2基因和蛋白明显下降，从而证明siRNA能有效阻断FOXA2基因表达。在利用QT-PCR对FOXA2基因沉默效率连续监测，发现FOXA2基因沉默效率在80%～93%范围波动，没有明显沉默效率丢失，这说明我们建立F-S细胞株比较稳定。

大量资料研究证实，HBV所有启动子和增强子均包含FOXA[11-13]结合位点。从实验中我们也可以观察到，3.5kbRNA 在HuH-7细胞中表达量低，在FOXA2基因沉默F-S细胞中表达量增加。3.5Kb[14] RNA 包含precore RNA 和pgRNA。Precore RNA 编码HBeAg，pgRNA编码聚合酶，同时也是HBV 病毒DNA模板，是HBV复制关键基因。FOXA2可以降低pgRNA表达，从而抑制HBV复制。大量资料表明，在非肝来源细胞中，FOXA2可以通过诱导核激素受体，从而抑制HBV病毒复制。也有报道指出FOXA2可直接阻断pgRNA延伸。这些结果都证实FOXA2具有负性调节HBV病毒复制功能，与本实验观点相符。

本实验发现FOXA2基因通过降低3.5kbRNA的表达抑制乙肝病毒的复制，深入研究FOXA家族，尤其是对FOXA2基因进一步探索，可以为乙型肝炎分子治疗[15-16]奠定基础。

参 考 文 献

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