小鼠胸腺胚后发育的组织学观察和外周血T淋巴细胞亚群的动态变化

刘晓东，彭利兰，陈科杰，彭 西，吴邦元（.贵州省黔东南民族职业技术学院，贵州凯里556000；.四川农业大学动物医学院，四川雅安6504）

小鼠胸腺胚后发育的组织学观察和外周血T淋巴细胞亚群的动态变化

刘晓东1，彭利兰1，陈科杰2，彭 西2，吴邦元2
（1.贵州省黔东南民族职业技术学院，贵州凯里556000；2.四川农业大学动物医学院，四川雅安625104）

为了研究动物胸腺发育结构与功能的关系，本试验以健康昆明小鼠为研究对象，通过组织形态和流式细胞术研究不同日龄小鼠胸腺的形态特点和淋巴细胞亚群的动态变化。结果表明：随着日龄的增加，小鼠胸腺髓质逐渐增宽，胸腺小体增多，结缔组织增加并分隔胸腺形成明显的小叶结构；外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+T淋巴细胞逐渐增多。可见小鼠到50日龄时胸腺已开始发育成熟，免疫功能逐渐增强。

胸腺；组织形态；T淋巴细胞亚群；流式细胞术；小鼠

胸腺是机体重要的免疫器官，能产生T淋巴细 胞直接参与机体的细胞免疫应答；此外胸腺上皮能分泌多种肽类，比如胸腺素、胸腺生长激素、胸腺刺激素等，这些激素的主要功能是保证免疫系统的发育，控制T淋巴细胞的分化和成熟，促进T淋巴细胞的活动，分化成熟的T淋巴细胞经血液运输到周围淋巴器官和淋巴组织，参与调节机体的免疫机能[1]。T淋巴细胞表面标志主要有TCR、CD2+、CD3+、CD4+、CDS+，CD4+和CDS+分别出现在不同功能亚群的T淋巴细胞表面，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+值以及CD3+CD4+与CD3+CDS+T细胞比值变化能较好地反映机体免疫能力的变化[2]。本试验采用昆明小鼠，通过十个采样点较为系统地阐释了胸腺形态及免疫能力的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物及日粮 健康怀孕雌鼠15只，购于四川农业大学动物生理实验室。分笼饲养，温度控制在1S～22℃，湿度控制在50%～60%，人为制造昼夜交替环境，自由饮水，每日饲喂两次饲料，定期更换饮水和垫料。幼鼠于20日龄断乳后雌雄分笼饲养。在各取样点随机抽取5只雌鼠和5只雄鼠进行试验。

日粮组成：玉米、豆饼、豆粕、鱼粉、磷酸氢钙、硫酸铜、各种维生素、微量元素、添加剂等。营养成分：粗蛋白≥22.5%，粗脂肪≥1.S%，粗纤维≤0.5%，粗灰分≤9.0%，钙1.0%～1.1%，总磷≥0.35%，食盐0.30%～0.S0%，赖氨酸≥0.35%，水分≤13.0%。符合实验小鼠的饲养标准[3]。

1.2 试剂和仪器 试剂：10%福尔马林，苏木精-伊红（HE）染色液，甲苯胺蓝（RTB）染色液，4% EDTA-Na2；仪器：流式细胞仪，漩涡机，石蜡切片机，光学显微镜，光学显微照相仪，数显恒温箱，电子天平，离心机。

1.3 HE染色和甲苯胺蓝染色 分别取1、3、5、7、10、15、20、25、35、50日龄雌雄小鼠各5只，颈椎脱臼处死，取胸腺，以10%福尔马林固定液固定，脱水，透明，石蜡包埋，5μm切片，每只小鼠的胸腺组织取4张切片，HE染色，100倍光镜下观察胸腺髓质、皮质、分叶情况，400倍光镜下观察胸腺中胸腺小体的形态和分布情况。

1.4 外周血T淋巴细胞亚群分析 分别取5、10、20、35、50日龄雌雄小鼠各5只，眼底静脉采血100 μL，用4%EDTA-Na2抗凝，加入大鼠抗小鼠CD3+、CD4+、CDS+单克隆抗体（单克隆抗体购自晶美生物制品有限公司），避光染色30min后，用溶血素裂解红细胞，1000r/min离心5min，弃上清；再用冰的PBS液冲洗一次后悬浮细胞，以流式细胞仪检测CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+T细胞占外周血淋巴细胞的百分比，并计算CD3+CD4+与CD3+CDS+T细胞的比值。

1.5 数据处理 用SPSS11.5分析软件进行数据统计、分析，采用单因素方差分析进行显著性检验。

2 结果

2.1 小鼠胸腺的形态学变化 HE染色可见1日龄小鼠胸腺髓质的淡染区较少，多呈散在分布，皮质区较宽，与髓质区分界不明显。随着日龄增加，着色较浅的髓质区逐渐增大，散在的髓质部分约从20日龄开始连通呈条带状，此后由分散分布逐渐互相贯穿形成大片髓质，50日龄可见胸腺中央区为整片髓质。10日龄之前胸腺小叶不明显，仅在被膜下局部区域见有少量的结缔组织；约25日龄时结缔组织将胸腺分隔成若干小叶，每一小叶中的髓质部分清晰可见；至50日龄时可见胸腺小叶的数量增加，且每一小叶都相对独立。胸腺髓质区可见着色较红的胸腺小体，1日龄胸腺小体较少，多见网状上皮细胞，随着日龄增加，约5日龄出现中央无核的胸腺小体，此后胸腺小体的数目缓慢增加，形态多种多样，呈椭圆形，也有呈囊状等不规则形状，主要是单个散在分布。

2.2 T淋巴细胞亚群的动态变化 随着日龄的增长，小鼠外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+T淋巴细胞数量呈现逐渐增多的趋势，且在20日龄达到较高水平，此后缓慢增长或出现轻微波动。详见表1、图1、图2。

表1 小鼠血液中T淋巴细胞亚群的变化情况

10日龄之前，雄性小鼠外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+T淋巴细胞数量所占百分比较小；20、35日龄和50日龄时，各亚群细胞百分比升高，与5日龄和10日龄比较差异显著（P＜0.05）；CD3+和CD3+CD4+T淋巴细胞百分比在20、35、50日龄时差异不显著（P＞0.05）；50日龄时，CD3+CDS+T淋巴细胞百分比极显著高于20日龄和35日龄。CD3+CD4+与CD3+CDS+T细胞比值在5、10、20日龄和35日龄时差异不显著，50日龄时显著降低（P＜0.05）。

雌性小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化情况与雄性小鼠相似。20、35、50日龄时，多数亚群细胞比例极显著高于5日龄和10日龄，CD3+CD4+与CD3+CDS+T细胞比值在5、10日龄时较高，20日龄时显著降低（P＜0.05），随后出现或高或低的波动。

图1日龄对雄性小鼠血液中T淋巴细胞亚群的影响

图2日龄对雌性小鼠血液中T淋巴细胞亚群的影响

3 讨论

3.1 胸腺胚后发育的形态和结构变化 本试验观察显示，从1日龄到50日龄，小鼠胸腺体积逐渐增大，表明出生之后至性成熟胸腺在持续发育，50日龄小鼠处于青壮年阶段，仍未观察到胸腺出现明显萎缩。此研究结果与前人的研究结果不尽一致。

组织学观察显示，随着日龄的增长，胸腺髓质部分的体积明显增大，并从最初的散在分布的团块转变为相互融合的大片区域，这与陈海英、郑玉涛等[4]在大鼠中观察到的“胸腺在大鼠幼年期时皮质厚，髓质只占胸腺体积极小部分，而随日龄增长胸腺皮质由厚变薄”现象是一致的。有研究表明，胸腺不仅是一个重要的免疫器官，也是一个分泌器官，如髓质上皮中的6型上皮是大型髓质上皮细胞，粗面内质网发达，含有大量囊泡，具有合成、分泌功能，可分泌胸腺素、胸腺生成素[5]。随着胸腺髓质增宽，其中含有的上皮细胞数量逐渐增加，胸腺素和胸腺生成素的分泌也就相应增多，从而活化更多的T淋巴细胞来参与机体免疫。

胸腺小体是胸腺的特殊结构，广泛分布于胸腺髓质部分。本试验通过HE染色观察到了着色较红且具有同心圆环状排列的胸腺小体。在胸腺小体中常可见许多细胞碎片，说明胸腺小体具有降解和除去死亡细胞的能力[6]。本试验中观察到完全无核的胸腺小体极少，常见中央无核、边缘清晰并可见细胞核的胸腺小体。

3.2 小鼠外周血T淋巴细胞的动态变化 基于T细胞表面CD抗原的不同，可将T淋巴细胞分为CD4+和CDS+两大亚群。CD4+亚群主要包括具有协助其他免疫细胞发挥功能的辅助性T细胞（Th）和诱导辅助性T细胞、抑制性T细胞的诱导性T细胞（Ti）。CDS+亚群则包括能抑制B细胞产生抗体和其他T淋巴细胞分化增殖的抑制性T细胞（Ts）以及能对靶细胞发挥杀伤作用的细胞毒性T细胞（Tc）[7]。本试验通过流式细胞仪对50日龄前小鼠血液中的T淋巴细胞计数，发现雄鼠在10日龄前的CD3+、CD3+CD4+和CD3+CDS+数量保持在较低水平，20日龄后大量增加，此后保持在较高水平；雌鼠虽有小幅波动，但变化规律与雄鼠相似。有资料显示健康动物的CD3+CD4+与CD3+CDS+T细胞比值应保持在2∶1[S]。从本试验可以看到，CD3+CD4+与CD3+CDS+T细胞比值在20日龄之前虽缓慢下降，但仍明显高于2∶1，此后该比值出现了或高或低的波动，约50日龄时比值接近于2∶1。说明小鼠外周血T淋巴细胞随着日龄的增加逐渐分化发育完全，在性成熟之后基本稳定。CD3+CD4+与CD3+CDS+T细胞比值在35日龄较高，此后逐渐下降，可能是由于性成熟后胸腺逐渐退变[7]引起。已有体内体外的研究证实，雌激素可使胸腺细胞结构出现退行性变化[9]。

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[2]蔡凤，祝继英7陈明琪.微生物学与免疫学[M].3版.北京：科学出版社，2014：165-167.

[3]卫生部人事司.医学实验动物饲养工[M].北京：人民卫生出版社，1999：156-162.

[4]陈海英，郑玉涛，范定怀，等.增龄对大鼠胸腺形态结构及细胞免疫功能的影响[J].沈阳医学院学报，2005，7（3）：157-159.

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[9] Rijhsinghani A G，Bhatia S K，Dantamneni L，et a1.Estrogen inhibits feta1 thymocyte deve1opment in vitro[J].Am J Reprod Immuno1，1997（37）：3S4-390.

The Histological Observation of Thymus during Postembryonic Period and the Dynamic Change of T Lymphocyte Subsets in Peripheral Blood of Mice

LIU Xiaodong1，PENG 1i1an1，CHEN Kejie2，et a1.
（1.Qiandongnan Nationa1 Vocationa1 and Technica1 Co11ege，Guizhou Kai1i 556000；2.Co11ege of Veterinary Medicine，Sichuan Agricu1tura1 University，Sichuan Ya＇an 625014，China）

In order to study the re1ationship between structure and function of the anima1 thymus deve1opment，hea1thy Kunming mice were used to study the morpho1ogica1 characteristic and the 1ymphocyte subsets changes of the thymus in different days.The resu1ts showed that the vo1ume of thymic medu11a part increased with the days of age increasing and the number of thymic corpusc1es disp1ayed the increasing trend.There were a few mast ce11s in thymus.The number of the periphera1 b1ood CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+T 1ymphocyte gradua11y increased，the ratio of CD3+CD4+and CD3+CDS+gradua11y reduced.The resu1ts indicated that the thymus of the mice had matured in 50 days of age and the immune function had strengthened gradua11y.

Thymus；Tissue morpho1ogica1；Subsets of T 1ymphocyte；F1ow cytometry；Mouse

SS52.4

B

1001-S964（2016）01-0021-03

2015-0S-25

刘晓东（19S4—），男，四川达州人，讲师，硕士，主要从事畜牧兽医教学科研工作，研究方向：动物病理学。