双酶复合水解酒糟制备可发酵糖的工艺研究

马文鹏，裴芳霞，任海伟，张丙云（.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉8300；.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050）



双酶复合水解酒糟制备可发酵糖的工艺研究

马文鹏1，裴芳霞2，任海伟2，张丙云2
（1.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉831100；2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050）

摘要：为将酒糟中纤维素和半纤维素组分转化成可发酵糖，从酶添加量、酶解时间和固液比等角度分别研究了纤维素酶和木聚糖酶的酶解参数，并考察2种酶不同添加方式对酒糟酶解糖化得率的影响，筛选适宜的酶解条件。结果表明，与纤维素酶或半纤维素酶单一酶水解相比，2种酶复合酶解效果较好，且2种酶同时添加的酶解得率最高。2种酶复合同步酶解的最优参数为纤维素酶添加量5 %，木聚糖酶添加量4 %，酶解时间为48 h，固液比为1∶20（m/v)，该条件下的还原糖和木糖得率分别为30.75 %和23.59 %。

关键词：酒糟；纤维素酶；木聚糖酶；酶解糖化；还原糖；木糖

中国是白酒生产和消费大国，白酒酿造会产生大量的废弃酒糟，每生产1 t白酒会产生鲜酒糟2～4 t。由于鲜酒糟酸度大，水分含量较高，极易腐败变质，若不能有效转化利用，会造成严重的厂区环境污染和资源浪费[1]。目前，酒糟除了直接用作家畜饲料外，还可用于生产有机肥、蛋白饲料、食用菌、燃料棒、活性炭和食醋等[2-3]。

酒糟是一种来源广泛的木质纤维生物质，富含纤维素、半纤维素和木质素等组分，通过酶解可以转化成葡萄糖和木糖等可发酵糖，进而作为生产乙醇、乳酸等生化产品的微生物发酵碳源。近年来，酶法水解木质纤维生物质因其降解彻底、无环境污染、副产物少、条件温和等优点而备受关注。欧阳嘉等[4]发现，纤维素酶Celluclast 1.5 L在酶用量10 FPIU/g、底物浓度50 g/L的条件下水解低聚木糖生产废渣48 h后，酶解得率为74.9 %，葡萄糖得率为35.1 %。朱新娜[5]研究发现，纤维素酶在酶浓度90 FPU/g、底物浓度47.2 g/L、温度50℃、pH4.8条件下作用棉花秸秆72 h后，还原糖产量为486.9 mg/g。余先纯等[6]研究发现，在温度51.15℃、反应时间42.08 h、纤维素酶用量28.75 U/g的优化条件下，玉米秸秆糖化得率能达到42.15 %。师静等[7]研究表明，巨菌草在纤维素酶用量44.8 U/g、底物浓度10 g/L、pH5.0和45℃条件下酶解60 h后，酶解液中还原糖含量为95.51 mg/g。上述研究主要集中于纤维素组分的专一性降解，但由于商业化的纤维素酶主要包括外切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-1,4-葡聚糖酶和β-1,4-葡萄糖苷酶3个组分[8]，使酶解后降解产物多以葡萄糖为主。

随着乙醇发酵基因工程菌的构建与研究，木糖等单糖也能被基因重组酵母等代谢利用[9]，因此，为进一步将除纤维素之外的半纤维素组分糖化降解为木糖等单糖，多酶复配进行酶解糖化的方法愈发受到重视。赵超等[10]采用纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶等组成的复合酶系对预处理后的玉米芯进行酶解，糖化得率为85.0 %。Zhao等[11]研究发现，当酶添加量为10 FPU/g时，用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶同步糖化甘蔗渣24 h，其多糖转化率高达80 %。Zhao等[12]进一步研究发现，甘蔗渣经NaOH-过氧乙酸预处理脱除木质素后，添加15 FPU/g的纤维素酶酶解120 h，还原糖得率升至92.04 %。Tabka 等[13]以麦秸为原料，发现10 U/g纤维素酶和3 U/g木聚糖酶是酶解呈协同作用的临界点。但是对多酶复配用于白酒糟糖化降解的报道还很少，国内仅有刘高梅[14]、陈喆[15-16]、刘跃红[17]进行了相关研究。

本研究以白酒糟为原料，从酶添加量、酶解时间和固液比等角度，在考察纤维素酶和木聚糖酶酶解参数的基础上，进一步研究2种酶不同添加复配方式对酒糟酶解糖化得率的影响，从而筛选得到最佳的酶解方式，为酒糟酶解糖化的转化利用奠定理论依据。

1　材料与方法

1. 1材料与设备

白酒糟：甘肃金徽酒股份有限公司，自然风干粉碎过40目筛，蛋白质16.42 %、纤维素33.17 %、半纤维素21.86 %。

试剂与耗材：纤维素酶（滤纸酶活10万U/g，最适温度50℃，最适pH4.8)和木聚糖酶（滤纸酶活5万U/g，最适温度50℃，最适pH4.8)，购自宁夏和氏璧生物技术有限公司；3,5-二硝基水杨酸等试剂均为分析纯。

仪器设备：HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；GZX-9240 MBE数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Cary 50紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1理化指标的测定

蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2010；纤维素和半纤维素含量测定参照国标GB/T 20805—2006、GB/T 20806—2006、GB/T 23881—2009；淀粉含量测定参照GB/T 5009.9—2008；还原糖的测定采用DNS法；木糖的测定采用间苯三酚比色法[18]。

1.2.2酒糟的酶解实验方案筛选

为确定纤维素酶和木聚糖酶适宜的酶添加量、酶解时间和料液比，首先进行了单因素实验，分别考察酶添加量（1 %、2 %、3 %、3 %、4 %、5 %和6 %，w/w)，酶解时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h），料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25，w/v）对酶解效果的影响。

具体方法：准确称取5.0 g酒糟置于一定体积的pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液，按照实验设计的酶添加量分别加入一定量的纤维素酶和木聚糖酶，混匀后置于50℃振荡培养箱中进行酶解实验。酶解结束后，沸水浴灭酶10 min，快速冷却后于3900 r/min下离心20 min，取上清液定容至100 mL，分别测定其还原糖和木糖浓度，计算糖得率。

在此基础上，按照表1的酶添加顺序进行双酶组合酶解方案的筛选，酶添加量和时间等参数与单因素实验一致，分步酶解过程中酶1水解结束、灭酶后方可再加入酶2继续作用。组合酶解结束后测定其还原糖浓度和木糖浓度，计算糖得率。

还原糖得率（X，%）和木糖得率（Y，%）的计算公式如下：

式中：v——酶解液的体积，L；

c1、c2——酶解液中的还原糖和木糖浓度，g/L；

m——酒糟质量，g；

w1、w2——酒糟中的纤维素和半纤维素质量分数，%。

表1 酶添加顺序组合方案设计

2　结果与分析

2.1单一酶酶解参数的筛选

2.1.1酶添加量对酶解效果的影响

由图1可知，不同的纤维素酶用量对酶解效率有较大影响，当纤维素酶用量从1 %增加到5 %，酶解24 h后，酶解液中还原糖得率从16.87 %增加到21.46 %，进一步提高纤维素酶用量，酶解得率的上升幅度趋于平缓。从尽可能降低纤维素酶成本的经济角度考虑，纤维素酶的适宜添加量为5 %。而木聚糖酶在添加量为4 %，酶解时间36 h时，木糖得率达到最大值17.46 %。这是由于在酶解初期，纤维素酶的酶切位点主要作用于无定形区，酶与无定形区的纤维分子结合产生催化酶解作用，酶解速度快。而随着酶解反应的进行，酶难以渗入纤维分子结晶区的致密结构，造成酶解速率降低，而酶解产物也会对酶解反应产生抑制作用[19]。

图1 酶添加量和时间对酶解得率的影响

2.1.2固液比对酶解效果的影响

由图2可知，纤维素酶和木聚糖酶在酶解过程中，随着固液比的减小，还原糖和木糖得率均呈逐渐上升的趋势，且在1∶20时达到最大值，分别为23.29 %和12.37 %。当继续增加液体比例，得率反而下降。这是由于料液比较高时，体系浓度和黏度值较高，酶解反应的传热传质进程易受高黏度影响，而液体体积的增加可以降低体系黏度，增加传质过程，同时增大了酶和底物的接触机率，但液体过量又会对酶解作用造成“稀释”，降低酶与底物的作用机率，故选择1∶20为最佳固液比。

图2 固液比对还原糖和木糖得率的影响

2.2酶添加方式对酶解得率的影响

由图3可知，纤维素酶单独作用对酒糟的酶解效果优于木聚糖酶，但与单一酶水解相比，双酶分步或同步添加的组合法均能有效提高酶解得率，且同步添加纤维素酶及木聚糖酶的还原糖和木糖得率最大，分别为30.75 %和23.59 %。一方面是因为木聚糖酶优先吸附到半纤维素和细小纤维的表面，半纤维素和细小纤维被酶解溶出。同时，木聚糖酶破坏了半纤维素对纤维素酶的吸附作用，使纤维素酶的酶解效率提高[20]。另一方面，木聚糖酶具有水解半纤维素和纤维素的双重活性，对纤维素表现出很大的亲和性，可以酶解半纤维素和细小纤维生成还原糖[21]，故纤维素酶和木聚糖酶同步复合酶解效果最好。

3　结论

采用纤维素酶和木聚糖酶对酒糟进行复合酶解，通过单因素实验和酶组合实验研究发现，纤维素酶和木聚糖酶双酶同步酶解效果最好，筛选后的纤维素酶和木聚糖酶添加量分别为5 %和4 %，二者同步酶解时间为48 h，固液比为1∶20（m/v)，该条件下，还原糖和木糖得率分别为30.75 %和23.59 %。

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The Preparation of Fermentable Sugar through the Hydrolysis of Distillers Grains by Two Enzymes

MAWenpeng1，PEI Fangxia2，REN Haiwei2and ZHANG Bingyun2
(1.Xinjiang Agricultural Vocational Technology College, Changji, Xinjiang 831100; 2. School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou,Gansu 730050, China)

Abstract:Cellulose and hemi-cellulose of distillers grains could be converted into fermentable sugar in practice. In this study, the hydrolysis parameters of cellulase and xylanase were investigated respectively from the angle of enzyme adding level, hydrolysis time, and solid-liquid ratio etc. Besides, the effects of different adding patterns of two enzymes on the yield of fermentable sugar were investigated. The results suggested that, the combined use of cellulase and xylanase was superior to single use of celluase/xylanase in the hydrolysis of distillers grains, and simultaneous addition of the two enzymes could achieve the highest yield of fermentable sugar. The best hydrolysis parameters were summed up as follows: the adding level of cellulase was 5 %, the adding level of xylanase was 4 %, hydrolysis time was 48 h, and solid-liquid ratio was 1∶20 (m/v). Under above conditions, the yield rates of reducing sugar and xylose were 30.75 % and 23.59 % respectively.

Key words:distillers grains; cellulase; xylanase; hydrolysis & saccharification; reducing sugar;xylose

通讯作者：任海伟（1983-），男，副教授，研究方向为食品科学，E-mail：rhw52571119@163.com。

作者简介：马文鹏（1983-），男，回族，副教授，硕士，研究方向为食品科学。

收稿日期：2015-11-16

基金项目：新疆维吾尔自治区高校科研计划项目青年教师科研培育基金（XJEDU2014S086）；甘肃省自然科学基金项目（148RJZA015）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015438

中图分类号：TS262.3；TS261.4；TS261.9

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）04-0089-04

优先数字出版时间：2016-01-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160122.1015.007.html。