外源性硫化氢对大鼠肠缺血再灌注损伤后肠黏膜细胞凋亡的影响

李龙腾，叶艳芳，胡殿宇，巩治华

(郑州铁路职业技术学院，河南 郑州　450052)



外源性硫化氢对大鼠肠缺血再灌注损伤后肠黏膜细胞凋亡的影响

李龙腾，叶艳芳，胡殿宇，巩治华

(郑州铁路职业技术学院，河南 郑州450052)

摘要：目的研究外源性硫化氢(H2S)对肠缺血再灌注损伤(I/RI)后肠黏膜细胞凋亡的影响，为临床治疗肠I/RI的新药开发提供依据。方法以硫氢化钠(NaHS)作为硫化氢的外源性供体，将32只健康雄性Wistar大鼠分为四组：(A)正常对照组、(B)假手术组、(C)肠IR/I模型组、(D)肠IR/I+H2S(NaHS,14umol/kg)干预组，每组8只。通过HE染色观察小肠组织的形态学改变，并用流式细胞术检测肠黏膜细胞的凋亡率。结果肠IR/I+H2S组比肠IR/I组的肠黏膜损伤明显减轻，肠黏膜细胞的凋亡率也明显降低。结论在肠I/RI中，H2S能降低肠黏膜细胞的凋亡，起到保护肠黏膜的作用。

关键词：硫化氢；缺血再灌注损伤；肠；细胞凋亡

肠缺血再灌注损伤(I/RI)是临床上常见的病理生理过程。研究表明，肠黏膜细胞凋亡是肠I/RI时细胞死亡的主要形式[1]。H2S作为一种新型的气体信号分子，可以在体内大部分组织中生成，参与多种生理与病理过程。研究表明，硫化氢对心肌、肺缺血再灌注损伤的细胞凋亡都有抑制作用[2-3]。但是H2S对肠I/RI肠黏膜细胞凋亡的影响尚未见报道。本研究通过建立肠I/RI模型，探讨H2S对肠I/RI大鼠肠黏膜细胞凋亡的影响。

1材料与方法

1.1实验动物

健康雄性Wistar大鼠32只，体重大约180 g，由郑州大学实验动物中心提供。

1.2试剂及器材

硫氢化钠(NaHS)，Sigma公司产品；流式细胞仪，美国Beckman公司产品；AnnexinV-FITC/PI试剂盒，美国BD公司产品。

1.3实验方法

1.3.1实验动物分组及肠缺血再灌注损伤模型的制作。32只健康雄性Wistar大鼠，禁食12 h后称重。随机分为四组，实验在相对无菌的环境下进行，并注意给动物保暖。(A)正常对照组：不给予任何干预措施，麻醉后取材。(B)假手术组：麻醉后打开腹腔，仅用手翻动肠道，1 h后缝合腹腔，4 h后麻醉取材。(C)肠I/RI模型组：麻醉后打开腹腔，夹闭肠系膜上动脉造成肠缺血，1 h后打开动脉夹再灌注前腹腔注射生理盐水，然后再灌注4 h后麻醉取材。(D)肠I/RI+H2S干预组：麻醉后打开腹腔，夹闭肠系膜上动脉造成肠缺血，1 h后打开动脉夹再灌注前腹腔注射NaHS(H2S的外源性供体,14 umol/kg)，然后再灌注4 h后麻醉取材。

1.3.2HE染色观察肠黏膜的形态学改变。在相对无菌的条件下，迅速打开腹腔取出肠组织，用生理盐水冲洗干净后，置于10%的甲醛溶液中固定，然后包埋、切片并进行HE染色，光镜下观察肠黏膜组织的形态学改变。

1.3.3流式细胞术检测肠黏膜细胞的凋亡率。将黏膜从肠组织上分离下来，迅速置于冷PBS中进行匀浆，用200目不锈钢筛网过滤，滤液以1000 r/min离心5 min，弃上清，用DMEM培养基吹打混匀成细胞悬液备用；将碎组织块以1:10加入0.1%的胶原酶，置于37 ℃的水浴中，用磁力棒搅拌、过滤、离心，制成细胞悬液。将所有分离的细胞悬液调整成密度为1×106/ml单细胞悬液，分装于离心管中，然后用冰冻PBS洗涤细胞，以1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞并置于加有100 ul冷buffer液的试管中，试管放置于冰上。在试管内加入5 ulAnnexinV-FITC和2.5 ulPI进行荧光标记，轻微混匀，避光孵育10 min，加入400 ul冰预冷的buffer液，轻微混匀，30 min内用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.3.4统计学处理。采用SPSS17.0软件对数据进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果分析

2.1H2S对肠黏膜的病理形态学影响

图1为H2S对肠膜的病理形态学影响。HE染色显示：正常对照组(图1A)和假手术组(图1B)肠黏膜绒毛完整，黏膜、黏膜下层和肌肉层分层清晰；与正常组相比，肠I/RI模型组(图1C)肠黏膜显示损伤严重，黏膜游离面可见散在的溃疡和出血灶，镜下可见黏膜上皮细胞脱落，绒毛断裂，顶端上皮抬高变尖，伴有部分上皮层同固有层分离，黏膜下层可见中性粒细胞浸润；肠I/RI+H2S干预组(图1D)肠黏膜有轻度损伤，绒毛上皮细胞结构较完整，有增生增厚现象,黏膜下见散在的中性粒细胞浸润,未见毛细血管和淋巴管扩张。

A:正常对照组　B:假手术组　C:肠I/RI模型组

2.2H2S对大鼠肠缺血再灌注损伤后肠黏膜细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示：与正常对照组和假手术组比较，肠I/RI模型组与肠I/RI+H2S干预组细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，但肠I/RI+H2S干预组细胞凋亡率比肠I/RI模型组又有明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组细胞凋亡率比正常对照组略有增高，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

A:正常对照组　B:假手术组　C:肠I/RI模型组

3讨论

由于在内脏器官中，肠组织对缺血比较敏感，所以严重外伤、大面积烧伤、出血性休克等应激状态下都存在有不同程度的肠I/RI，并因此可能造成肠粘膜屏障功能障碍和肠道菌群移位，诱发全身炎症反应，引起肝、肺、肾等多种严重的并发症，甚至导致死亡。

大量研究表明：细胞凋亡是肠I/RI肠黏膜损伤的重要原因之一[4]，而且主要发生在再灌注的1 t到6 t之间[5]。本实验缺血再灌注模型采用缺血1 t再灌注4 t，经HE染色发现：肠黏膜上皮细胞脱落，绒毛断裂，顶端上皮抬高变尖，伴有部分上皮层同固有层分离，黏膜下层可见中性粒细胞浸润，肠I/RI模型组的肠黏膜损伤严重，说明本实验成功地复制了肠I/RI模型。并且通过流式细胞术检测发现，肠I/RI模型组的肠黏膜细胞凋亡严重，所以在肠I/RI的治疗中必须重视肠黏膜细胞的凋亡。

近些年，H2S在细胞凋亡中的作用得到广泛关注，NaHS作为H2S供体已经广泛应用于H2S的研究当中。因为在溶液中它能够分解为Na+和HS-，HS-和H+结合产生H2S[6]。本实验通过腹腔注射NaHS来干预肠I/RI。HE染色表明，干预后肠黏膜的损伤明显减轻，通过流式细胞术再次证明H2S可以减轻肠I/RI中肠黏膜细胞凋亡。

4结语

在肠缺血再灌注损伤中，肠黏膜有明显损伤，肠黏膜细胞也有明显的凋亡，而H2S能够在一定程度上改善这种损伤和凋亡情况，而且在后续的实验中我们将继续更深入探讨可能的作用机制，希望能够为临床新药的开发提供更多的依据。

参考文献

[1]Ikeda H,Suzuki Y,Suzuki M,et al. Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischaemia and ischaemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium.[J].Gut,1998, 42(4):530-537.

[2]李凌,常芳.硫化氢对大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的影响[J].河南医学研究,2005, 14(2):107-109.

[3]王兴民,季海锋,王万铁,等.硫化氢供体硫氢化钠对肺缺血-再灌注损伤细胞凋亡的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2010,15(5):496-501.

[4]Benjamin I J.Viewing a stressful episode of ER:is ATF6 the triage nurse?[J].Circulation Research,2006,98(9):1120-1122.

[5]Yinfei T,Nathalie D,Chao W,et al.Ubiquitous calpains promote caspase-12 and JNK activation during endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis.[J]. Journal of Biological Chemistry,2006,281(23):16016-16024.

[6]Jr B R,Bus J S,Popp J A,et al.A Critical Review of the Literature on Hydrogen Sulfide Toxicity[J].Critical Reviews in Toxicology,1984,13(1):25-97.

[责任编辑：方艳]

The Effects of Exogenous Hydrogen Sulfide on Intestinal Mucosal Cell Apoptosis after Intestinal Ischemia-reperfusion Injury in Rat

LI Longteng, YE Yanfang, HU Dianyu, GONG Zhihua

(Zhengzhou Railway Vocational and Technical College，Zhengzhou 450052, China)

Abstract:Objective: To study the effects of exogenous hydrogen sulfide (H2S)on intestinal mucosal cell apoptosis after intestinal ischemia-reperfusion injury(I/RI). Methods: Sodium hydrosulfide(NaHS)was taken as a donor of H2S. 32 Wistar rats were divided equally into 4 groups: (A)Nomal group(B)Sham operation group (C)Intestinal I/RI model group(D)Intestinal I/RI+H2S(NaHS,14umol/kg)group. Intestinal tissue alteration was observed with HE assay.The apoptosis of intestinal mucosal cells was measured by flow cytometry. Results:Compared with I/RI group, the intestinal mucosal injury and cell apoptosis of I/RI+H2S group was significantly reduced. Conclusion: In the intestinal I/RI, H2S can reduce the apoptosis of intestinal mucosal cells, and can also protect the intestinal mucosa.

Key words:hydrogen sulfide; ischemia reperfusion injury; intestinal; cell apoptosis

中图分类号:R364.1

文献标志码:A

文章编号：1008-6811(2016)01-0048-03

作者简介：李龙腾(1979—)，男，河南商丘人，郑州铁路职业技术学院医学基础部讲师。叶艳芳(1981—)，女，河南许昌人，郑州铁路职业技术学院医学基础部助教。胡殿宇(1965—)，女，河南延津人，郑州铁路职业技术学院教授。巩治华(1961—)，男，山西左权人，郑州铁路职业技术学院医学基础部副教授。

基金项目：郑州铁路职业技术学院重点科技课题(2013JKY004)；河南省科技厅2015年河南省基础与前沿技术研究项目(152300410183)

收稿日期：2015-12-08