榛蘑中多糖水提法工艺优化

多糖是具有多种生物活性的大分子物质。本实验采用热水浸提的方法从榛蘑中提取多糖，通过单因素试验和正交试验，研究了浸提温度、时间以及料液比对多糖提取率的影响。从单因素试验表分析可得温度是影响多糖提取率的主要因素。通过正交试验确定最佳提取工艺为料液比1：30、温度100℃、浸提时间为4h，在最佳提取工艺时，榛蘑多糖提取率为3.28%。

多糖是由单糖基通过糖苷键连接而成的化合物，具有抗肿瘤、抗病毒，促进免疫等多种生物活性。此外它还能影响细胞的分裂和分化，调节细胞的生长和衰老。大多数真菌多糖易被生物降解，长期服用可达到防治肿瘤的目的，是一种很好的广谱免疫增强剂。因此，多糖在生物医药、保健食品、农业生产、化妆品等方面具有独特的应用价值。

榛蘑（Armillariella mellea）产于黑龙江三江平原地区，属于真菌类物质。现代医学研究表明，榛蘑具有防癌抗癌、防治病毒性疾病稳定血压等功能，目前从榛蘑中提取粗多糖工艺的研究还很少。多糖的提取工艺方法有多种，但醇提、碱提、酸提等都能不同程度的破坏多糖，因此本实验采用热水浸提法。

1 材料及方法

1.1材料、试剂及仪器

材料：购于内蒙古海拉尔地区。

试剂：无水乙醇，85%、95%乙醇，丙酮，无水乙醚，蒽酮，浓硫酸，葡萄糖，三氯甲烷，正丁醇。

仪器：电子天平，恒温水浴锅，电热恒温干燥箱，循环水式多用真空泵，离心机，分液漏斗，分光光度计。

1.2方法

1.2.1多糖的提取流程

将榛蘑原料水洗，60℃烘干后粉碎。称取一定量的榛蘑粉末加入相应体积的水，置于冰箱中，冻融处理后在一定温度下进行一定时间的提取。将提取后的溶液过滤，剩余残渣重复提取2-3次，合并提取液加热浓缩至1/3体积。用Sevag法除蛋白，再用3倍量95%的乙醇醇析得粗多糖沉淀。分别用85%、95%和无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤，干燥后得粗多糖。

1.2.2多糖的初步鉴定及含量测定

本实验采用蒽酮-硫酸法测定总的多糖含量。蒽酮-硫酸法是利用糖类在较高温度下被浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生有色物质，反应后溶液呈蓝色，于620nm处有最大吸收。本实验利用蒽酮-硫酸法制得标准曲线，根据曲线得出回归方程，再测定待测样品溶液的吸光度，代入回归方程后计算出多糖含量。

1.2.3粗多糖蛋白质除杂

本实验采用Sevag法脱蛋白。Sevag法是利用蛋白质遇有机溶剂变性而不溶于水的特点将其分离出去。将适当浓缩的提取液加入到分液漏斗中按1/5的量加入sevag溶液（三氯甲烷：正丁醇=4：1）充分振荡，静止，分离直至无乳白色变性蛋白质析出。但由于sevag液能破坏糖苷键，因此除蛋白次数不能过多。

2 结果与讨论

2.1制作葡萄糖标准曲线

将葡萄糖粉烘干，制成0.1mg/ml标准溶液。取0.00ml，0.15ml，0.3ml，0.45ml，0.60ml，0.75ml标准液于6只试管中，加蒸馏水至2ml，蒽酮试剂4ml，沸水浴10min.取出，在752N型紫外分光光度计上测定A620，回归方程为Y=0.006X+0.0011，拟合系数R=0.9999。

表1 标准曲线数据

多糖提取率 = （X×125×W2/W3×1000×W 1）×100%

式中：X—从标准曲线查得A620对应之样品的糖量（mg）

W1：称取干样品的质量（g）

W2：由W1提取的粗多糖的质量 （g）

W3：从W2中称取的用于分析测定的粗多糖质量 （g）

2.2 单因素对榛蘑可溶性多糖提取率的影响

2.2.1 料液比的影响

在温度85℃和时间3小时不变的情况下采用料液比为1：15、1：20、1：25、1：30四个水平进行实验。其结果如图2所示，多糖量随料液比的增加而增加，当料液比达到1：25以后多糖的提取率基本不变。

2.2.2 温度的影响

固定料液比1：25，提取时间3h，温度采用85℃、90℃、95℃、100℃进行试验，温度对多糖提取率的影响，如图3所示，温度对榛蘑多糖的提取率有显著的影响，温度的上升伴随着多糖提取率的显著上升，在100℃时提取率达到最大值。

2.2.3 时间的影响

在料液比为1：25、温度100℃时，提取时间采用3h、4h、5h三个水平分别进行实验。改变时间对多糖的提取率的影响如图4所示，随着热水浸提时间的增加榛蘑中多糖提取率也有所增加，但4h以后多糖提取率保持恒定不变。

2.3 热水浸提榛蘑中可溶性多糖提取率的正交试验

通过单因素实验可知提取温度是影响多糖提取率的最关键因素，其次是料液比，时间对多糖提取率的影响最小。在此基础上选定三因素三水平进行正交试验。

2.3.1 正交试验设计和结果的直观分析

由上述正交表显示：温度是影响多糖提取率的最关键因素。榛蘑水提提取工艺最优条件为A3B3C2，即料液比1：30，温度100℃，浸提时间4h。在最佳提取工艺条件下，榛蘑多糖的提取率为3.28%。

2.4有关提取流程的其它讨论

（1）样品不能粉碎得太细，否则加热搅拌后成胡状很难过滤。

（2）一般的醇析方法是将乙醇倒入多糖溶液中搅拌静止，而实验采用的方法是将黄褐色的多糖浓缩液缓慢加入乙醇当中，不搅拌静止后多糖会缓慢上浮，容器底部留下深褐色的色素沉积物对脱色起到一定作用[9]。

（3）析出的粗多糖抽滤时在滤纸上垫一层细丝绸可减少多糖的损失。

3 结论

在热水提取榛蘑可溶性多糖的过程中，温度是影响多糖提取率的最关键因素。多糖提取的最佳工艺条件为料液比1：30，温度100℃，浸提时间4小时，此时榛蘑多糖的提取率为3.28%。

通讯作者：黄学文

基金项目：内蒙古自治区自然科学基金，项目编号2013MS0522.