一步法RT-PCR快速检测猪瘟活疫苗中BVDV外源病毒方法的建立

李天芝，于新友，沈志强(.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 56600；.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 56600)



一步法RT-PCR快速检测猪瘟活疫苗中BVDV外源病毒方法的建立

李天芝1，于新友1，沈志强2
(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

摘 要：为检测商品化猪瘟细胞毒活疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染，根据牛病毒性腹泻病毒5′端非编码区基因保守序列设计引物，建立了检测牛病毒性腹泻病毒一步法反转录—聚合酶链(RT-PCR)方法，并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对牛病毒性腹泻病毒扩增结果为阳性，对照毒株扩增结果均为阴性，对牛病毒性腹泻病毒检测的灵敏性为1pg总RNA量，应用该方法，检测了32批猪瘟细胞毒活疫苗样品，以上结果表明该一步法RT-PCR方法检测速度快、特异性强、敏感性高，可用于猪瘟细胞毒活疫苗中污染的牛病毒性腹泻病毒外源病毒检测。

关键词：猪瘟；牛病毒性腹泻病毒；检测

猪瘟(CSF)由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪高度传染、致死性疾病，我国将猪瘟列为一类动物疫病[1]。牛病毒性腹泻病(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的以发热、黏膜糜烂溃疡、腹泻、咳嗽、持续性感染与免疫耐受以及怀孕母牛流产、畸胎甚至死胎等为主要特征的牛传染病[2]，我国将牛病毒性腹泻病列为禁止入境的二类检疫对象。BVDV和CSFV同属于黄病毒科瘟病毒属中的成员，BVDV还可引起猪、骆驼、羊、鹿等多种动物感染发病[3]，给各国养殖业造成了严重的经济损失。猪感染BVDV后可产生类似慢性猪瘟的临床症状和病理变化，怀孕母猪可致发生流产，产出畸形胎儿，免疫BVDV污染的猪瘟细胞毒活疫苗是猪感染BVDV一种重要途径。BVDV主要通过生产过程中使用的牛血清、胰酶、牛睾丸等材料以及容器、设备污染猪瘟细胞活疫苗。对猪感染BVDV的现状必须有清醒的认识和必要的防控措施。本研究根据GenBank公布BVDV基因序列，针对具有很高保守性的5′端非编码区基因设计1对特异性引物，建立了一种特异、敏感的BVDV检测方法，以确保疫苗的安全、有效，为商品化猪瘟细胞毒活疫苗中BVDV污染提供一种有效的分子生物学检测方法。

1　 材料和方法

1.1病毒株与病料

牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等均由本实验室保存，32批猪瘟细胞毒活疫苗样品购买自不同厂家。

1.2工具酶及试剂盒

AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司、DNA Marker、PCR相关试剂、限制性内切酶、MD18-T载体、DNA凝胶回收试剂盒购自大连宝生物公司。

1.3RT-PCR引物设计与合成

参照GenBank中登录的BVDV 5′端非编码区序列，设计1对引物，上游引物：5′-AGGCTAG CCATGCCCTTAGT-3′，下游引物：5′-TCTGCAGCACCCTAT CAGG-3′，扩增BVDV 5′端非编码区序列244 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4病毒基因组RNA的提取

按AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒使用说明书提取BVDV的RNA，并提取其他几种病毒的RNA。

1.5一步法 RT-PCR扩增及条件优化

以RNA为模板进行一步法RTPCR扩增，反应体系为20 μL。各参数为50℃逆转录30 min，95℃预变性3 min，然后进入95 ℃ 20 S、56 ℃20 S、72 ℃ 20 S，共35个循环，最后72 ℃延伸8 min。取5 μL产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。同时对各扩增条件进行优化，包括退火温度(50～60 ℃梯度温度，每2 ℃为1个梯度)、引物浓度(0.1～1.1μmol/L，每0.2μmol/L为1个梯度)等，反应体系均为20μL。

1.6扩增产物的检测及鉴定

首先取扩增产物5μL在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与pMD18-T克隆载体在16 ℃恒温金属浴中过夜连接，转化感受态菌株DH5α。挑取单个的转化菌落，加LB溶液培养18 h后用质粒提取试剂盒抽提质粒，用PCR方法进行鉴定，将阳性克隆送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定，将测序结果与参照的BVDV序列同源性比较。

1.7特异性试验

分别提取牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的RNA，用已建立的方法进行扩增。

1.8敏感性试验

BVDV 病毒提取RNA后定量，然后10倍梯度稀释提取的病毒基因组RNA，使其分别相当于含有10 ng RNA、1 ng RNA、100 pg RNA、10 pg RNA、1 pg RNA、0.1 pg RNA的含量，分别进行一步法RT-PCR检测，确定其敏感性。

1.9重复性试验

用建立的一步法RT-PCR检测方法，检测3份牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型，重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。

1.10猪瘟细胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的检测

将购买的32批猪瘟细胞毒活疫苗样品稀释为含有1头份/200μL作为检测样品进行一步法RT-PCR扩增BVDV，同时设立阳性对照和阴性对照。并同时参照相关规程用细胞培养法检验并比较二者的符合性。

2　 结果与分析

2.1扩增产物的检测及鉴定

PCR扩增产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳，在244 bp处可见特异性扩增带，与预期大小相符(图1)。挑取PCR鉴定阳性的菌液送上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结果显示，插入到T载体的基因片段的核苷酸序列与BVDV(登录号：KJ620017)的序列相似性为100%。

图1　牛病毒性腹泻病毒扩增结果

2.2特异性试验

利用设计的引物和确定的最佳扩增条件分别对牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的核酸进行一步法RT-PCR。结果6个样品中只有BVDV能扩增出大小为244 bp目的片段，而其他均未扩增出相应的片段(图2)，表明本试验建立的方法有很好的特异性。

图2　特异性试验

2.3敏感性试验

取5μ L PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约244 bp附近出现特异性条带，与预期产物大小相符。从结果可以看出，引物的一步法RT-PCR检测灵敏度可以达到1 pg RNA(图3)。

图3　敏感性试验

2.4重复性试验经过3次重复操作，结果一致，说明建立的方法是稳定、可靠的。

2.5猪瘟细胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的检测

用建立的BVDV 一步法 RT-PCR检测方法，共检测了32批商品化猪瘟细胞毒活疫苗样品，其中有2批有BVDV污染。细胞培养法的检测结果与一步法 RT-PCR检测方法的结果相同。

3　讨论

范学政等[4]用RT-PCR方法对23批次的猪瘟疫苗进行BVDV检测，结果显示，5批次猪瘟疫苗被BVDV污染，污染率达21.74%。范仲鑫等[5]用RTPCR方法对湖南省内销售的10个厂家48个批次的猪瘟细胞苗进行BVDV病毒核酸检测，结果：10个厂家的猪瘟细胞苗中有5个厂家检出BVDV核酸阳性，48个批次中有9批次检出BVDV核酸阳性，阳性率为18.75%。因此，必须对猪瘟活疫苗中的BVDV进行严格检验，禁止接种BVDV污染的猪瘟活疫苗，按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版3部)外源病毒检验方法，对猪瘟细胞毒活疫苗中BVDV外源病毒的检验主要采取细胞培养法，该法操作复杂，耗时间长，传统的两部法RT-PCR检测方法时间长，操作繁琐，需要先反转录成cDNA再进行PCR扩增，本试验建立的BVDV一步法RTPCR检测方法操作简单，不需要单独做反转录，反转录与PCR扩增一步完成，能在3 h内检出BVDV，不仅节省了时间，而且减少了操作步骤，可方便快捷地扩增出目的片段，适合于大规模推广应用。本试验建立的BVDV一步法RT-PCR检测方法，共检测了32批商品化猪瘟细胞毒活疫苗样品，其中有2批有BVDV污染，与细胞培养法检测结果一致。本试验所建立的方法为猪场基层兽医工作者开展猪瘟细胞毒活疫苗样品BVDV污染的检测提供了一种简单、有效的分子生物学检测方法。

参考文献

[1]国际兽疫局.哺乳动物，禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].3版.农业部畜牧兽医局，译.1996：128-135.

[2]殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997：538-548.

[3]王新平，周绪斌.猪感染牛病毒性腹泻病毒的研究进展[J].动物医学进展，1998，19(1)：1-3.

[4]范学政，宁宜宝，王琴，等.用RTPCR方法检测猪瘟细胞苗中污染牛病毒性腹泻病毒[J].中国兽医杂志，2010，46(1)：8-10.

[5]范仲鑫，张朝阳，刘道新，等.猪瘟细胞苗污染牛病毒性腹泻病毒情况调查[J].畜牧与兽医，2011，43(7)：84-86.

(收稿日期：2015-11-09)

作者简介：李天芝(1985-)，女，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断技术研究.

基金项目：山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-06-011-14)；滨州市科技发展计划项目(2013GG0304)