四川规模化猪场腹泻仔猪病毒性腹泻病原的分子检测

蔡雨函，周远成，艾 能，李 碧，潘 梦（四川华神兽用生物制品有限公司 四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川 成都610299）



四川规模化猪场腹泻仔猪病毒性腹泻病原的分子检测

蔡雨函，周远成，艾 能，李 碧，潘 梦
（四川华神兽用生物制品有限公司 四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川 成都610299）

摘 要：为了解四川地区仔猪腹泻中病毒性病原的感染情况，应用RT-PCR方法对来自四川不同地区的20个猪场的仔猪腹泻病料进行了9种病毒性病原的检测。结果显示阳性率最高的为PRoV，其次为PKBV、PEDV、PBoV、PToV、MRV、AV、TGEV、PSaV&PNoV；检测的这20份样品中均存在混合感染的情况。

关键词：仔猪腹泻；病毒性病原；分子检测

在集约化养猪生产条件下，仔猪腹泻十分普遍，该病不仅会造成仔猪成活率下降，感染2周内仔猪发病率高达100%，死亡率在80%以上，而且还会造成生长发育受阻、饲料报酬降低等后果；且有报道表明，近年来因腹泻死亡的仔猪占仔猪死亡总数38.9%[1]，严重威胁着养猪业的健康发展。为了了解四川地区仔猪腹泻中病毒性病原的感染情况，本实验集成了多种病毒性病原检测方法对来自四川不同地区的20个猪场的仔猪腹泻病料进行了RT-PCR检测。

1　 材料与方法

1.1主要试剂

RNA提取试剂Trizol regment、反转录试剂盒、Hs-Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker等购于TAKARA(大连)。

1.2引物设计

本文所用引物如表1所示[2-3]，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3病料采集与处理

于2014年秋冬季节共收集来自四川省20个规模化猪场发生仔猪腹泻的肠道或粪便样品20份。取适量的组织样品用剪刀剪碎后放入匀浆器里，加入1 mL PBS进行匀浆，匀浆充分后12 000 r/min，离心 10 min，取上清置-80 ℃保存；粪便样品则转移到离心管中，12 000 r/min离心10 min，取上清分装后置-80 ℃保存。

1.4RT-PCR检测

1.4.1总 RNA 的提取与 cDNA的合成

取200 μL上清液加入1 mL Trizol regment，反复颠倒混匀，室温作用5 min后12 000 r/min离心10 min，吸取上清转移到无RNAase的EP管中；加入200 μL氯仿，震荡混匀并室温静置10 min后12 000 r/min离心10 min；取上清于新的无RNAase的EP管中，加入等体积的异丙醇沉淀RNA，室温静置10 min后12 000 r/min离心15 min，再用1 mL 700 mL/L冰乙醇洗涤1次；轻轻弃去剩余的无水乙醇，自然风干，加入20 μL 无RNAase双蒸水，反复吹打以溶解RNA，同时加入RNAase抑制剂2 μL，-20 ℃保存备用。取无RNAase PCR管，加入随机引物50 ng，总RNA 5 μL，混匀后68 ℃处理5 min，结束后迅速置冰上放置2 min，然后按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。

1.4.2PCR 扩增

按照Hs Taq说明书，采用25 μL反应体系，并参照参考文献[2，3]的扩增程序进行PCR反应。PCR结束后取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

2　 实验结果

RT-PCR扩增结果如表2所示，PEDV、TGEV、PRoV、PToV、P K B V、P B o V、A V、M R V、PSaV&PNoV阳性率分别为65%、20%、75%、40%、70%、55%、35%、35%、10%。其中感染阳性率最高的为PRoV，其次为PKBV、PEDV、PBoV、PToV、MRV、AV、TGEV、PSaV&PNoV。检测的这20份样品中存在多种病毒性病原混合感染的情况，感染最复杂的猪场可同时检测到6种病毒性病原。有70% (14/20)的猪场存在PEDV/PRoV/ TGEV两两混合感染的情况，其中PEDV/PRoV两两感染的情况最为严重。

3　讨论

仔猪腹泻是一种典型的多因素性疾病，其发生率极高，能够引起仔猪腹泻的原因有很多，大致包括细菌、病毒及寄生虫等传染性因素及营养性腹泻、应激因素等非传染性因素，而由病毒引起的腹泻发病急、传播范围广、传播速度快、危害最严重，因此是当前研究的重点[4]。目前许多病毒可致仔猪腹泻，其中传染性胃肠炎病毒(TGEV)流行性腹泻病毒(PEDV)和轮状病毒(RV)是引起仔猪病毒性腹泻的 3 种主要病毒，病毒间常呈单独感染或混合感染；而越来越多研究报道一些新的病毒与腹泻有关，如环曲病毒(PToV)、嵴病毒(PKBV)、博卡病毒(PBoV)，星状病毒(AV)等[5-6]。

为了了解四川省仔猪腹泻中病毒性病原的感染情况，本实验对20个猪场进行了9种病毒性腹泻病原的检测。结果显示：PRoV阳性率最高为75%，其次则为PKBV、PEDV和PBoV，其阳性率分别为70%、65%和55%，其余5种病原阳性率均低于50%。许多对仔猪病毒性腹泻流行病学调查表明PEDV的感染阳性率最高，是引起仔猪腹泻的主要病原[7]，但本研究结果显示PRoV检测阳性率最高，其原因一方面可能是所选择的检测方法不同所引起：本实验采用的是巢氏RT-PCR，而其他研究则多采用RT-PCR或能同时检测多种病原的多重PCR，但巢氏RT-PCR的灵敏度通常要比普通PCR高100倍，另一方面可能是因为PRoV即是引起四川省2014年仔猪腹泻最主要的病原。其次，新出现的病毒如PKBV和PBoV的阳性率也较高，但是对于仔猪腹泻是否由这些新病毒引起的说法还需要进一步研究。

所有被检猪场均存在混合感染的现象，其中只有3个猪场是2种病毒混合感染，其余均是3种以上病毒混合感染，而且还有2个猪场甚至达到6种病毒性病原混合感染，但在猪群腹泻的发病过程中究竟是混合感染病毒中的一种起了主要作用，还是共同感染协同起作用，这个问题还有待于更进一步研究。在混合感染的猪场中，有70%的猪场存在PEDV/PRoV/TGEV两两混合感染的情况，表明当前防控PEDV、PRoV、TGEV仍是降低仔猪腹泻发生率的关键问题。总之，在四川地区流行的仔猪病毒性腹泻病例中，疾病感染情况非常复杂，这在生产养殖中对仔猪腹泻防控增加了难度，而本实验结果将有助于指导养殖场(户)做好疫苗免疫与防控工作。

表2　RT-PCR检测结果

参考文献

[1]王明福，彭羽，肖光明.论溶菌酶防治仔猪大肠杆菌性腹泻推广应用前景[J].中国畜禽种业，2009(3)：132-135.

[2]ZHOU Y，CHEN L，ZHU L，et al.Molecular Detection of Porcine Torovirus in Piglets with Diarrhea in Southwest China[J].The Scientific World Journal，2013(5)： 984282.

[3]蔡雨函，朱玲，周远成，等.猪博卡病毒双重PCR检测方法的建立及其应用[J].中国兽医科学，2013，43(8)：833-838.

[4]田冲，欧阳金旭，罗碧毅，等.仔猪病毒性腹泻的流行病学研究进展[J].长江大学学报自然科学版： 石油/农学(旬刊)，2013，10(2)： 57-60.

[5]单玉平，王益军，董燕萍，等.新生仔猪腹泻病的诊断及防控[J].畜牧兽医科技信息，2014 (8)： 69-70.

[6]刘好朋，胡京京，贺东生.仔猪病毒性腹泻分析及综合防制措施[J].养猪，2014 (5)： 121-122.

[7]薛瑞雪，田野，田夫林，等.山东省部分地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查[J].中国预防兽医学报，2015，37(4)：254-257.

(收稿日期：2015-07-09)

作者简介：蔡雨函（1990-），女，四川南充人。通讯作者：周远成，博士，主要从事动物传染病病原分子生物学研究，E-mail：abtczyc@163.com