棉花枯萎病菌培养条件的研究

刘冬梅

摘 要：以棉花枯萎菌为试验材料，研究不同温度、pH值对枯萎菌菌落生长速度和菌丝生长状态的影响，目的在于进一步了解枯萎菌的极限生长条件，以期明确棉花枯萎病菌生理生态特性，为棉花枯萎病的检疫检测和综合治理提供依据。结果表明，供试菌株的最适生长温度为28 ℃，最高极限生长温度为35 ℃，最低极限生长温度为10 ℃。在25～28 ℃范围内菌落生长速度无明显变化，但生长状态有变化。温度为34 ℃时，生长受到明显抑制。供试菌株生长的最适pH值为7～12，最高极限生长pH值为13，最低极限生长pH值为4。

关键词：棉花；枯萎菌；培养条件；温度；pH

中图分类号：S562 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.04.026

Abstract： In order to study the effects of different temperature and pH on the rate of mycelium growth and conidia production， Anyang Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectumusing was used as experimental material.The purpose is to shed light on the utmost limit of growth condition of Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum， make clear the physiological and ecological properties of it and provide foundations for quarantine detection and comprehensive treatment. The results showed that the range of temperature was from 10 ℃ to 35 ℃ for the mycelium growth of Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum， and the optimum temperature was 28 ℃.There was not a distinct variations on the rate of mycelium growth at the range from 25 ℃ to 28 ℃，but growth state had some variations. Growth was inhibited obviously at the temperature of 34 ℃， pH was from 4 to 13，with the optimum being 7 to 12.

Key words： cotton；Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum；culture condition；temperature；pH

棉花枯萎病是重要土传病害，由尖孢镰刀菌（Fusarium owysporum f.sp. vasinfecturn）引起 [1-3]。棉花枯萎病是世界性病害，给棉花生产造成严重损失[4]。棉花枯萎病菌是植物病害中系统浸染、土壤传播、抗逆性强、致病性变异较大的病原菌之一，极难防治 [5]。

目前，我国各大棉区已普遍发生。棉花枯萎病从子叶期开始就可发病，病株矮小，蕾铃脱落率高，单株结铃数下降，铃质量减轻，棉纤维强度下降，从而影响棉花的产量和品质[6]。病害严重的1～2片真叶时即可造成死苗，花蕾期发病高峰时可成片死苗。

目前，关于棉花黄萎病的研究很多，而枯萎病的研究很少。虽然棉花枯萎病和黄萎病的病原不同，但都作用于植株的维管束，侵染过程类似。所以人们往往从黄萎的角度来理解枯萎，而棉花枯萎病和黄萎病之间存在很多差异。棉花枯萎病菌可在土壤中或棉株残体上进行腐生生活，又可在棉株内进行寄生生活。既能随运输工具远距离传播，又能随作业、流水近距离扩散，造成病菌在土壤中不断扩散和积累，加重发病率和危害程度。病菌可在土壤中存活6～7年，厚垣孢子存活甚至长达15年。病菌由棉苗根尖侵入棉株，在导管中大量繁殖的菌丝及棉株受病菌刺激产生的物质，阻碍水分运输；小型孢子随棉株体液向上扩散至全株，破坏棉株细胞，影响棉株生长发育。

关于棉花枯萎菌的生物学特性已有一些研究。本试验目的在于进一步了解枯萎菌的极限生长条件，以期明确棉花枯萎病菌生理生态特性，为棉花枯萎病的检疫检测和综合治理提供依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 由中国农科院棉花研究所植保室（植物与微生物互作重点实验室）保存。

1.1.2 主要仪器 电子天平，超净工作台，恒温培养箱，高压灭菌锅，酸度仪，721型分光光度计等。

1.2 方 法

1.2.1 查氏（Gzapek）培养基的配制 查氏培养基（Gzapek）的配制参照钱寸柔（1999）等[7]。

1.2.2 极限温度摸索方法 将固体培养基在121 ℃、1.1 kg·cm-2 的压力下高温高压灭菌20 min。然后将灭菌后的培养基倒入培养皿中，每皿约20 mL。供试菌株在Gzapek平板上28 ℃恒温培养6 d，用打孔器和接种针沿菌落边缘取直径为1 cm的菌丝块分别移植于Gzapek平板中央，即一点法[8]，置于4，18，25，28，32，34，35，36 ℃下培养，分别做4次重复。并分别于第2、3、4、5、6、7天测定记载各个处理的菌落直径，并记录菌落色泽、菌丝密度等。

1.2.3 极限pH值摸索方法 固体培养基灭菌前，用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl分别调至pH值为2，3，4，5，7，9，11，12，13，并在121 ℃、1.1 kg·cm-2 的压力下高温高压灭菌20 min（其中pH值为2，3，4，5的培养基没有凝固，仍为液体培养基）。然后将灭菌后的培养基倒入培养皿中，每皿内约20 mL。用打孔器和接种针取供试菌株菌丝块（直径为1 cm）置于不同pH值的Gzapek平板中央，分别做4次重复，28 ℃恒温培养。并分别于第2、3、4、5、6、7天测定记载各个处理的菌落直径，并记录菌落色泽、菌丝密度。

液体培养基灭菌前，用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl分别调至pH值为2，3，5，7，9，11，12，分别取100 mL培养基倒入250 mL三角瓶中，做3次重复。并在121 ℃、1.1 kg·cm-2 的压力下高温高压灭菌20 min，而后取供试菌株菌丝块（直径为1 cm）置于不同pH值的液体培养基中，28 ℃130 r·min-1恒温振荡培养至第5天[9]，分别取约5 mL的菌液，用四层纱布过滤后，在595 nm处，用分光光度计测其OD值。此后继续振荡培养至第18 天，分别取约30 mL的菌液，放入预先称量好的干净的三角瓶中，在80 ℃的干燥箱中烘干，称其干质量，并记录其干质量。

1.2.4 极限温度摸索方法 将固体培养基在121 ℃、1.1 kg·cm-2的压力下高温高压灭菌20 min。然后将灭菌后的培养基倒入培养皿中，每皿内约20 mL。用加液枪取振荡培养14 d的枯萎菌液0.2 mL分别移植于Gzapek平板中央，置于4，18，25，28，32，36 ℃下培养，分别做4次重复。并于第3、4天观察菌落生长状况。

2 结果与分析

2.1 温度对病菌生长的影响

由表1及图1可知，供试菌株在Gzapek培养基上以28 ℃生长最快，第7天已长满平板。在10～35 ℃均能生长，且菌丝在第4～5天生长明显加快。34 ℃时生长明显受到抑制，在低于10 ℃和高于35 ℃时不能生长。由图1还可看出菌株在25～28 ℃范围内，生长速度比较平稳，几乎成直线状态，生长无明显变化。菌株在32 ℃条件下，生长速度也比较平稳，几乎成直线状态，但生长速度明显较28 ℃减慢。菌株在34 ℃条件下，生长速度明显受到抑制，但最终也会长满平板。菌株在18 ℃条件下，在第2天时，菌落边缘有少量的菌丝，菌斑直径增长不是太明显。但在第2～3天中生长速度明显较以后几天快，在第5～6天，菌斑直径已经接近32 ℃条件下的菌斑直径。预计18 ℃条件下生长的菌株会比32 ℃条件下的菌株先长满平板。35 ℃条件下培养的菌株，在培养的前5 d几乎不生长，只在菌落的边缘出现极少量的菌丝，在第6天时可看到菌斑直径的增大。

由图2知，在28，32，34 ℃时菌丝颜色均为白色，且菌丝浓密。在25 ℃时菌丝也为白色，但菌丝较28，32，34 ℃时稀疏，菌落中央呈透明状，边缘为白色较浓密的菌丝。而在18 ℃时菌落前7 d呈浅粉色，并且菌落呈透明状，菌丝生长的不太旺盛，但此后观察发现菌落边缘会出现白色菌丝，以至长满整个平板。

2.2 pH值对病菌生长的影响

由表2及图3可知，供试菌株在pH值为4～13的Gzapek培养基上均能生长，供试菌株对pH值的要求不是太苛刻。最适pH值为7～12，且pH值为7，9，11时的菌斑直径与pH12时的几乎无差异，在pH值2，3时，各菌株均停止生长。由图2还可看出，菌株在pH值为7～13范围内培养时，在第2～3天时的生长速度比此后几天快。

由图4可知：pH值为11，12时比pH值为7，9的菌丝浓密。pH值为13时，菌斑直径与pH值为7～12的差异不大。但其菌丝呈透明状，菌丝量很少，表现为生长受到明显抑制。

3 讨 论

棉花枯萎菌菌丝较长且浓密，接种时用打孔器打孔，并辅以接种针接种。虽然所取直径精确度高，但其操作极为不便，并且容易造成污染。若在长有菌株的平皿上，用米尺量其长宽分别为1 cm，并用记号笔标记，再用刀片和镊子取菌块，则更为方便，省时，且可减少污染。

在极限温度和极限pH值的摸索中，先设计较大梯度，观察其生长状况。再在其较大梯度之间设计几个梯度，可以很快捷有效的找出其最适条件和极限条件。本试验以查氏培养基为基本培养基，得出28 ℃为最适温度，在10～35 ℃范围内均可生长。这一点和前人用PDA培养基所得结果基本一致，但前人论述在pH值4～10范围的PDA培养基上均能生长，最适pH值为6～7[10]。本试验用查氏培养基得出pH值4～13范围内枯萎菌均能生长，最适pH值为7～12。这可能与供试菌株，试验设备以及试验操作过程有一定的关系。

在接种固体培养基时，最好不用液体的菌液。因为菌液不会被固体培养基立即吸收，在倒置培养中，会导致菌液向固体培养基的周缘流动，以致于不能正确测量菌斑直径，而且容易造成污染。

棉花枯萎菌菌丝聚集成团状，不利于其毒素的释放，不能利用常规分析释放外毒素的菌株的分析方法分析。如测其菌液的OD值，对棉花枯萎菌不能使用。查氏（Gzapek）培养基有一定的重量，用称其干质量的方法分析枯萎菌的生长状况，试验结果也不理想。

参考文献：

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