补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞BMP2表达及TRPV5/TRPV6通道影响的实验研究

高　毅，穆春晖，刁志虹，李　敏，王双双，杨　琳(⒈河北省中医院口腔科,河北 石家庄 05007；.北京市东城区第一人民医院口腔科，北京 0000；3.河北省石家庄市第一医院口腔科，河北 石家庄 0500)



·论著·

补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞BMP2表达及TRPV5/TRPV6通道影响的实验研究

高毅1，穆春晖2，刁志虹3*，李敏1，王双双1，杨琳1(⒈河北省中医院口腔科,河北 石家庄 050017；2.北京市东城区第一人民医院口腔科，北京 100010；3.河北省石家庄市第一医院口腔科，河北 石家庄 050011)

[摘要]目的观察补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)表达及TRPV5/TRPV6通道的影响，探讨补肾活血固齿方成骨的作用机制。方法按体表面积折算等效剂量的补肾活血固齿方灌胃大鼠，制备含药血清；等剂量生理盐水灌胃大鼠，制备无药血清作为对照。用10%含药血清、无药血清分别培养MC3T3-E1细胞24、48、72 h，RT-PCR法检测MC3T3-E1细胞BMP2、TRPV5/TRPV6 mRNA的表达。结果含药血清组MC3T3-E1细胞的BMP2、TRPV6 mRNA表达量较无药血清组增加(P<0.05)，且随时间延长有逐渐增加趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。含药血清组和无药血清组MC3T3-E1细胞中均未检测到TRPV5 mRNA的表达。结论补肾活血固齿方可能是通过钙离子通道TRPV6上调BMP2的表达、诱导成骨细胞分化的。

[关键词]牙周疾病；补肾活血固齿方；实时聚合酶链反应

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.009

牙周炎是以牙周袋形成、袋壁炎症、牙槽骨进行性吸收和破坏、牙齿松动为主要症状的口腔常见病、多发病，牙周炎不仅导致成人牙齿过早丧失，并可诱发各种全身性疾病，严重影响其健康。中医运用中药，尤其是补肾中药治疗牙周炎引起的牙齿松动有着悠久历史。根治牙周炎的关键是通过成骨细胞和破骨细胞的调节作用阻止牙槽骨吸收或促进牙槽骨的再生，成骨细胞在这一过程中发挥重要作用。成骨细胞表达的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)是骨修复中最主要的诱导因子，其亚型BMP2的诱导成骨能力较为明显，BMP2通过Smads和p38MAPK信号通路促进成骨细胞表达多种特异性成骨因子如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)，产生相应蛋白分泌到细胞外基质中，使细胞外基质矿化，进而完成成骨。钙离子通道TRPV5/TRPV6通过调节成骨细胞内钙离子含量的变化，激活p38MAPK通路，促进成骨细胞分化。本研究采用中药血清体外培养小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)，观察补肾活血固齿方对细胞BMP2及TRPV5/TRPV6通道表达的影响，探讨补肾活血固齿方对成骨细胞分化的作用机制，旨在为临床用药提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级健康雄性SD系大鼠20只，体质量280～300 g，由河北省实验动物中心提供(实验动物许可证号：冀医动管字号1312020)。饲养条件：室温保持在18～25 ℃，空气流通，12 h维持光照，动物在笼中自由摄食饮水。

1.2中药制备淫羊藿15 g、补骨脂15 g、熟地黄10 g、当归10 g、丹参10 g、知母10 g、甘草3 g。药物加10倍量蒸馏水煎煮1.5 h过滤，加同量蒸馏水重煎1.5 h过滤，合并滤液浓缩至150 mL装袋备用(含生药量 0.487 g/mL)。

1.3细胞株小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14 (MC3T3-E1 Subclone14)，购自中国科学院上海细胞库 (ATCC CRL-2594)。

1.4主要试剂和仪器α-MEM培养基(GIBCO公司)，胎牛血清(PAA Laboraties GmbH)，叶酸(Amresco)， β-疏基乙醇(北京鼎国生物技术有限责任公司)，肌醇(北京索莱宝科技股份有限公司)，胰酶(Amresco)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine totraacetic acid,EDTA)(天津市永大化学试剂开发公司)，戊巴比妥(华北制药股份有限公司)，TAE缓冲液(Solarbio公司)，溴化乙锭(ethidium bromide,EB)(Solarbio公司)，琼脂糖(Solarbio公司)，Trizol(Solarbio公司)，反转录试剂盒(Invitrogen公司)，PCR SuperMix扩增试剂盒(Invitrogen公司)，100 bp DNA Ladder(TANGEN)。HF240二氧化碳培养箱(上海力申科学仪器有限公司)，BSC-1100ⅡA2生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造有限公司)，TE2000-U荧光倒置显微镜(NiKon)，B40型医用低速离心机(安新县白洋离心机厂)，D-37520高速离心机(Thermo ELECTRON CORPORATION)，HKA-A2450-230精密电子天平(BEL Engineering)，DDY-7C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，一体化凝胶成像分析仪(北京赛智创业科技有限公司)，96孔PCR仪(Applied Biosystems)。

1.5血清制备20只SD大鼠按随机数字表法分为含药血清组和无药血清组，每组10只。含药血清组的血清制备：补肾活血固齿方经煎制后，按体表面积折算等效剂量，0.487 g(生药)/kg(体质量)计算用药量。SD大鼠10只每日灌胃2次，连续灌胃7 d，第7天第2次灌胃后间隔2 h再次灌胃，末次灌胃1 h后，腹主动脉取血，3 000 r/min离心20 min，取上清，56 ℃水浴灭活30 min，抽滤除菌后，-20 ℃保存备用。无药血清组的血清来自等剂量生理盐水灌胃的大鼠，灌胃操作及血清制备方法同前。

1.6细胞培养MC3T3-E1细胞培养于α-MEM培养基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 g/L链霉素)，5% CO2，95%湿度，恒温37 ℃的细胞培养箱中培养，每3 d换液1次，1周左右细胞基本铺满瓶底后传代。吸去原培养液，PBS溶液清洗2遍，0.25%胰酶1 mL，37 ℃消化1 min，镜下观察细胞收缩，变圆，α-MEM培养基1.5 mL终止消化，反复吹打细胞，使其悬浮，移至离心管，1 000 r/min离心5 min，吸去上清液，加入适量α-MEM培养基，混悬细胞，每个培养瓶接种细胞30 000个。

1.7RT-PCR法检测MC3T3-E1细胞中BMP2、TRPV5/TRPV6 mRNA的表达

1.7.1分组按“1.6”方法培养细胞2 d后分别换用含药血清(培基含10%含药血清)和无药血清(培基含10%无药血清)，继续培养24、48、72 h，分别检测不同时间点MC3T3-E1细胞BMP2、TRPV5/TRPV6 mRNA的表达。

1.7.2细胞总RNA的提取每瓶细胞，倒掉培基，PBS洗2遍，加入Trizol试剂1 mL，吹打混匀细胞，加入大EP管，冰上静置10 min。加入氯仿200 μL，剧烈振荡12 s，冰上静置3 min,4 ℃，12 000 r/min离心15 min。吸取上层无色液相加入新的EP管中。新EP管加入500 μL异丙醇，混匀，冰上静置10 min。12 000 r/min离心10 min，弃上清。EP管中加入1 mL 75%乙醇，振荡使沉淀悬浮，静置1 min。9 000 r/min离心10 min。吸干剩余乙醇。白色透明状沉淀加入去核酶水20 μL，吹打混匀即为提取的总RNA，-20 ℃保存。

1.7.3逆转录反应分别取各样品总RNA 5 μg，使用逆转录试剂盒进行逆转录，所得溶液即为cDNA，置冰浴待用。

1.7.4扩增反应TRPV5、TRPV6、BMP2、GAPDH引物序列及反应条件，见表1。

表1　TRPV5、TRPV6、BMP2、GAPDH引物序列及反应条件

1.7.5产物检测PCR产物1 μL与5×100 bp DNA Ladder 5μL混匀加入琼脂糖胶孔， 110 mV电压电泳40 min，自动凝胶成像分析仪进行辉度扫描并观察拍照，QuatityOne软件进行辉度值比较。以GAPDH作为内对照，计算TRPV5、TRPV6、BMP2的相对含量，结果以TRPV5、TRPV6、BMP2条带灰度值占GAPDH条带灰度值的百分率表示mRNA的表达量。

1.8统计学方法应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料比较分别采用t检验和F检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1RT-PCR法检测BMP2 mRNA表达2组MC3T3-E1细胞中均有BMP2 mRNA表达，且表达量随时间的延长有增加趋势，但组内24、48、72 h之间差异无统计学意义(P>0.05)；而含药血清组24、48、 72 h BMP2 mRNA表达量均较无药血清组高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表22组不同时间BMP2 mRNA表达比较

Table 2BMP2 mRNA expression level at different time

points in two groups

组别培养时间24h48h72hFP无药血清组0.040±0.0270.044±0.0210.048±0.0270.1520.861含药血清组0.081±0.0360.088±0.0180.098±0.0150.7120.506t 2.2323.8973.965P 0.0490.0030.003

2.2RT-PCR法检测TRPV5/TRPV6 mRNA表达2组MC3T3-E1细胞中均无TRPV5 mRNA表达。2组MC3T3-E1细胞中均有TRPV6 mRNA表达，且表达量均随时间的延长有逐渐增加趋势，但组内24、48、72 h之间差异无统计学意义(P>0.05)；而含药血清组24、48和72 h TRPV6 mRNA表达量均较无药血清组高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表32组不同时间TRPV6 mRNA表达比较

Table 3TRPV6 mRNA expression level at different time

points in two groups

组别培养时间24h48h72hFP无药血清组0.094±0.0310.106±0.0230.115±0.0290.8570.444含药血清组0.292±0.0690.301±0.0420.311±0.0360.2080.815t 6.4129.97510.380P 0.0000.0000.003

3讨论

“血清药理学”由田代真一于1988年提出，原理是使用中药或中药复方给动物灌服一定时间后采集、分离动物血清，用含有药物成分的血清进行体外实验的一种半体内实验方法[1]。该方法可有效防止中药制剂自身理化性质对实验的干扰，反映中药在胃肠道内的消化吸收、生物转化、产生药效的真实过程，克服了中药制剂的体内代谢物或机体反应物等有效成分引起的假阴性和机体非吸收物的体外作用造成的假阳性[2]，客观模拟了药物与机体的相互作用，代表了药物在体内产生作用的真正有效成分。

BMPs是促进骨形成和诱导成骨细胞分化的重要细胞因子[3]。BMPs可以诱导前成骨细胞向成骨细胞分化，诱导未定型和定型的成骨细胞经过趋化、分裂、分化等过程，不可逆的分化成骨[4]。BMPs的亚型BMP2的诱导成骨能力较为明显，研究表明BMP2通过Smads和p38MAPK信号通路调控成骨细胞分化，BMP2与Ⅱ型受体(type Ⅱ bone morphogenetic protein receptor,BMPR-Ⅱ)结合后磷酸化Ⅰ型受体(BMPR-Ⅰ)，磷酸化的BMPR-Ⅰ进一步磷酸化与BMPs特异作用的Smads蛋白，Smads蛋白进入细胞核后通过增加特异性转录因子Runx2的表达促进ALP合成，进而促进成骨细胞分化[5-6]。BMP2也可以与BMPR-Ⅰ形成复合体，复合体与桥蛋白作用，介导下游信号分子TAB1的活化，活化的TAB1激活TAK1信号途径，TAK1信号途径进而激活p38MAPK通路，从而促进成骨细胞表达ALP[7-8]。ALP是骨形成所必需的酶，ALP 的表达标志成骨细胞分化的开始，ALP活性是成骨细胞功能及分化程度的指标[9-10]。ALP表达升高是启动矿化的必备条件，作用是水解磷酸酯为沉积羟基磷灰石提供必要的磷酸，水解焦磷酸盐，解除其对矿物质形成的抑制作用，从而促进羟磷灰石的形成，促进细胞成熟、钙化[11-12]。本研究结果显示，含药血清和无药血清培养的MC3T3-E1细胞均有BMP2 mRNA表达，含药血清BMP2 mRNA表达量较无药血清高。表明含药血清可显著地增加BMP2 mRNA的表达水平。因此，认为补肾活血固齿方可通过提高BMP2 mRNA表达水平诱导MC3T3-E1细胞的成骨分化。

TRPV5/TRPV6通道是高选择性钙离子通道，细胞内钙离子浓度较低时，钙离子通过该通道进入细胞，参与多种信号通路调控成骨细胞的分化、成熟以及骨的形成[13]。Hoenderop等[14]研究表明，TRPV5/TRPV6通道通过调节成骨细胞内钙离子含量的变化，调节p38MAPK信号通路，最终调节成骨细胞增殖及骨代谢；p38MAPK通路可以调节成骨细胞分化过程中ALP的表达，促进成骨细胞分化成熟。本研究发现含药血清和无药血清培养的MC3T3-E1细胞中均有TRPV6 mRNA表达，且表达量均随时间的延长而增加，含药血清组的表达量较无药血清高(P<0.05)；而含药血清及无药血清培养的MC3T3-E1细胞中均未检测到TRPV5 mRNA的表达。李富春等[15]实验发现，大鼠成骨细胞分化过程中 TRPV5/TRPV6 通道均有不同程度阳性表达，且TRPV5/TRPV6 的表达随诱导分化时间的延长逐渐增强。van der Eerden等[16]在人股骨分离的成骨细胞中没有检测到TRPV5 mRNA。这些研究结果与本研究结果相符，但这些结果无法确定TRPV5通道在MC3T3-E1细胞中不存在，TRPV5 mRNA的表达是否存在窗口期或者需要特定的激活条件，需要进一步研究。

本研究结果表明，补肾活血固齿方可提高MC3T3-E1细胞中BMP2、TRPV6 mRNA的表达水平，进而通过p38MAPK信号通路调节成骨细胞分化和骨代谢。

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(本文编辑：许卓文)

The experimental study of effects of Bushen Huoxue Guchi formula on BMP2 and TRPV5/TRPV6 channels expressions in MC3T3-E1 cells

GAO Yi1, MU Chun-hui2, DIAO Zhi-hong3*, LI Min1,WANG Shuang-shuang1, YANG Lin1

(1.Department of Stomatology, the Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hebei Province, Shijiazhuang 050017, China; 2.Department of Stomatology,the First People′s Hospital of Beijing Dongcheng District, Beijing100010, China; 3.Department of Stomatology,the First Hospital of Shijiazhuang City,Hebei Province, Shijiazhuang 050011, China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of Bushen Huoxue Guchi Formula on bone morphogenetic protein 2(BMP2) and TRPV5/TRPV6 channel expressions, and to explore the mechanism of Bushen Huoxue Guchi Formula in bone formation. MethodsHerb-contained serum was prepared from rats by gavage with Bushen Huoxue Guchi Formula by using body surface area converted equivalent dose. Blank-contained serum as control group was prepared by gavage with normal saline. The BMP2 and TRPV5/TRPV6 mRNA expressions were detected in MC3T3-E1 cells by RT-PCR after the cells were treated with 10% herb-contained serum or blank-contained serum for 24 h, 48 h and 72 h, respectively. ResultsBMP2, TRPV6 mRNA were significantly increased in herb-contained serum treatment group compared with blank-contained serum treatment group(P<0.05). With the prolongation of time, the mRNA expression of BMP2 and TRPV6 had a gragually increased tendency, but there was no statistically significant difference(P>0.05). TRPV5 mRNA was not detected either in herb-contained serum treatment group or blank-contained serum treatment group. ConclusionBushen Huoxue Guchi Formula may upregulate BMP2 expression through TRPV6 channels to induce differentiation of osteoblast.

[Key words]periodontal diseases; Bushen Huoxue Guchi Formula; real-time polymerase chain reaction

[中图分类号]R781.4

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)03-0280-05

[作者简介]高毅(1965-)，女，河北行唐人，河北省中医院主任医师，医学博士，从事口腔疾病诊治研究。*通讯作者。E-mail:yanjingshe651130@163.com

[基金项目]河北省科学技术研究与发展计划项目(13277730D)；河北省中医药管理局科研计划项目(2014028)

[收稿日期]2016-01-29；[修回日期]2016-03-01