Box-Benhnken设计优化鼠曲草类黄酮超声波辅助提取工艺

林华婷, 吕　峰, 黄国钞

(福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)



Box-Benhnken设计优化鼠曲草类黄酮超声波辅助提取工艺

林华婷, 吕峰, 黄国钞

(福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

摘要:基于单因素试验结果，采用4因素5水平的Box-Benhnken设计，优化超声波辅助提取鼠曲草类黄酮的关键工艺参数.结果表明，类黄酮提取的最佳工艺条件为：提取温度35 ℃、乙醇含量73%、超声波功率350 W、料液比1∶35，在此工艺条件下，超声波辅助提取50 min，类黄酮的提取率可达15.25%.

关键词:鼠曲草; 类黄酮; 超声波辅助提取; 优化

鼠耳草学名鼠曲草(GnaphliumaffineD.Don)，为菊科鼠麴草属植物[1]，以野生为主，资源丰富[2].鼠曲草性味甘、平，具有消喉火、解热、去毒、调中益气、止泄，除痰、压时气和去热嗽[3]等功效，可用于感冒咳嗽、支气管炎、哮喘、高血压、蚕豆病、风湿和腰腿痛等治疗，外用于治跌打损伤、毒蛇咬等[4].相关研究表明，鼠曲草富含挥发油、氨基酸、多糖和类黄酮等[5]，目前对鼠曲草类黄酮的研究鲜有报道.

类黄酮广泛存在于植物中，其基本骨架为C6-C3-C6[6]，具有突出的药理活性和营养保健作用[7-8].近年来关于植物类黄酮的提取工艺常有报道，类黄酮的提取方法主要有浸提法、酶解法、超临界萃取法和超声波辅助提取法等[9-10].其中，超声波辅助提取技术具有省时、快速、简单和节约能源等特点，目前已广泛用于天然植物有效成分的提取，是一种理想的类黄酮提取方法[11].

Box-Benhnken设计可有效快速评价因素与指标间的非线性关系，确定最佳条件，具有方便、精度高和周期短等优点，目前被广泛应用于食品、医学和生物学等领域.本试验采用超声波辅助提取鼠曲草类黄酮，基于考察影响提取类黄酮的主要因素，通过Box-Benhnken设计[12]，优化提取工艺的关键参数，探索一种快速、简便和高效提取类黄酮的方法，旨在为鼠曲草的综合开发利用及从鼠曲草中提取生物活性成分提供参考.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料鼠曲草鲜草采自福建屏南地区，烘干后粉碎过60目筛，备用.

1.1.2试剂芦丁(生化试剂，纯度为98%)由上海恒远生物公司生产；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠均为国产分析纯.

1.1.3仪器设备主要仪器设备有BS201分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)、BL-500 A型高速多功能粉碎机(浙江省康永市松青五金工具厂)、SK8210 LHC超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)、DHG-9240 A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)和UV-1800 PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司).

1.2方法

1.2.1芦丁标准曲线的绘制曲线的绘制参考亚硝酸钠—硝酸铝分光光度法[13].准确称取芦丁粉末20 mg，用50%乙醇溶解并定容至100 mL，制得含量为0.2 mg·mL-1的芦丁标准液.分别吸取芦丁标准液0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0和25.0 mL于100 mL容量瓶中，各加入1.0 mL 5%亚硝酸钠，摇匀放置6 min，再加入1.0 mL 10%硝酸铝，摇匀放置6 min，最后加入10.0 mL 4%氢氧化钠，用50%乙醇定容至刻度，摇匀后放置10 min，用紫外可见分光光度计在波长510 nm处测定其光密度.以光密度为纵坐标，样品含量为横坐标，制得的芦丁标准曲线线性回归方程为：Y=9.105 7X+0.017 5(R2=0.992 5).对照品含量在0~0.06 mg·mL-1的范围内，线性良好.

1.2.2类黄酮提取率的测定与计算吸取1 mL类黄酮提取液于50 mL容量瓶中，其余方法与“1.2.1”的相同.在510 nm波长处测定类黄酮的光密度(Y)，将Y代入芦丁的标准回归方程，得到提取液中类黄酮的含量(X).

类黄酮提取率/%=(X×n×V/m)×100.式中：X—提取液中类黄酮的含量(mg·mL-1)，n—稀释倍数，V—提取液的原体积(mL)，m—鼠曲草样品质量(g).

1.2.3Box-Benhnken设计优化超声波辅助提取类黄酮的关键工艺以前期试验确定的超声波辅助提取类黄酮的主要影响因素(提取温度、乙醇含量、超声波功率、料液比)为变因，以类黄酮提取率为响应值，采用4因素5水平的Box-Benhnken设计[14]，优化类黄酮提取工艺.响应面因素水平编码表见表1.

表1　响应面因素水平编码表

2结果与分析

2.1Box-Benhnken设计及结果

为进一步确定各因素对类黄酮提取率的影响程度，采用方差分析对所得回归方程的显著性及回归拟合程度进行考察[15].响应面回归模型方差分析结果(表3)显示：方程回归极显著(P<0.000 1)；失拟项P=0.142>0.05，不显著.表明该回归方程是可靠的，能够与实际情况拟合，可以反映各因素与响应值之间的相互作用关系.

表2　Box-Benhnken设计及结果

表3　二次响应面回归模型方差分析1)

1)F表示方程拟合性；P表示模型显著性，**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05).

2.2试验因素对类黄酮提取率的影响

2.2.1单因素效应对回归方程进行降维分析，将提取温度、乙醇含量、超声波功率和料液比4个因素中的3个分别固定在零水平上，考察各因素在不同水平上对类黄酮提取率的影响，得到以其中一个因素为决策变量的偏子回归模型.采用Excel软件绘制各因素对类黄酮提取率影响的曲线(图1).

由回归系数检验值F(表3)和图1可知，在本试验条件下，各因素对类黄酮提取率影响的显著性大小为：乙醇含量>料液比>超声波功率>提取温度.其中，乙醇含量、超声波功率和料液比对类黄酮提取率的影响极显著(P<0.01)，提取温度对提取率的影响不显著(P>0.05).固定其他3个因素的编码水平为0时，当提取温度的编码水平为-2~0(25~35 ℃)时，类黄酮提取率随着提取温度的提高而增大至最大值(14.95%)；编码水平超过0后，类黄酮提取率随着提取温度的提高呈微弱下降趋势.而乙醇含量、超声波功率和料液比与类黄酮提取率关系的曲线类似，即乙醇含量、超声波功率和料液比的编码水平均为1(分别为75%、350 W和1∶35)时，类黄酮提取率随着其水平的提高而增大至最大值(分别为15.22%、15.01%和15.12%)；编码水平超过1后，类黄酮提取率则呈下降趋势.

2.2.2因素间的互作效应根据回归方程得到的不同因素对类黄酮提取率影响的三维响应面图和二维平面上的等高线图如图2~4所示.每个响应面对其中两个影响因素的交互作用进行分析和评价时，另外两个影响因素的编码水平均固定在0上，响应面坡度陡峭程度和等高线椭圆形状反映交互效应强弱趋势.在α=0.01水平上，提取温度与乙醇含量、乙醇含量与料液比的交互作用对类黄酮提取率有极显著影响(P<0.01)；在α=0.05水平上，提取温度与超声波功率的交互作用对类黄酮提取率有显著影响(P<0.05).本试验只对上述3个交互作用进行分析.

由图2可知，乙醇含量与提取温度交互作用的等高线呈椭圆形，表明两因素的交互作用强，影响极显著(P<0.01).当提取温度为37.5 ℃，乙醇含量为75%时，对类黄酮提取率的影响呈极显著(P<0.01)正相关交互关系；反之，当提取温度高于37.5 ℃，乙醇含量高于75%时，两因素的交互作用对类黄酮提取率的影响则呈极显著(P<0.01)负相关关系.当以乙醇作为提取溶剂时，适当提高提取温度，除了反应体系中的分子动能增加外，乙醇中的小气泡(空化核)增多，对产生空化作用有利.与此同时，随着乙醇含量的增加，使提取液的极性逐渐与类黄酮的极性接近，从而提高类黄酮的溶出率.乙醇含量较低时，提取液中的糖类和蛋白质等水溶性物质大量溶出，细胞内部组织的孔道受堵，导致颗粒细胞中的类黄酮渗出受阻[16].因此在一定的水平范围内，当乙醇含量和提取温度适当提高时，由于二者的协同作用均可使植物细胞中类黄酮的提取率明显提高.但当提取温度过高时，气泡中的蒸气压太高，使气泡在闭合时增强了缓冲作用导致空化效应减弱，且乙醇挥发量也增加，而乙醇含量过高时，提取液的极性逐渐偏离类黄酮的极性，影响类黄酮的溶出；此外，乙醇含量过高时，杂质溶出量增多，易与类黄酮竞争同乙醇结合，亦导致类黄酮提取率降低[17].因此，当提取温度和乙醇含量过高时，两因素的交互作用对类黄酮提取率的影响呈极显著(P<0.01)负相关关系.

由图3可知，超声波功率与提取温度交互作用的等高线呈椭圆形，表明提取温度与超声波功率的交互作用在试验水平范围内对类黄酮提取率的影响显著(P<0.05).超声波功率与提取温度对类黄酮提取率的影响先呈显著(P<0.05)正相关交互关系，当超声波功率高于375 W，提取温度高于30 ℃时，两因素对类黄酮提取率的影响呈负相关交互关系.当超声波功率处于低水平时，随着超声波功率的增大，反应体系的机械及空化作用增强，分子的扩散速度增大[18]，可提高类黄酮的提取率.此外，适当提高提取温度亦有利于植物细胞中类黄酮的溶出，当二者在一定范围内同时增大时，由于协同作用可使类黄酮提取率提高得更明显；反之，当超声波功率过高，强烈的空化作用会导致有效提取成分的破坏[19-20]， 而提取温度过高时会导致乙醇溶剂的挥发[21]，二者结合可导致类黄酮提取率下降.因此，在一定范围内增大超声波功率和提取温度有助于提高类黄酮的提取率，但超声波功率和提取温度过高都会导致类黄酮提取率的下降.

由图4可知，料液比与乙醇含量交互作用的等高线呈椭圆形，表明乙醇含量与料液比的交互作用在试验水平范围内对类黄酮提取的影响极显著(P<0.01).随着乙醇含量和料液比的增加，类黄酮提取率呈先增大后减小的趋势，当乙醇含量为72.5%，料液比为1∶35时，类黄酮提取率达到最大值(15.20%).料液比太小，提取的溶剂量不足会影响类黄酮的溶出；增大料液比有助于类黄酮的提取，且适当提高乙醇含量，使提取液的极性逐渐与类黄酮的极性接近，从而促进类黄酮的溶出.当料液比和乙醇含量同时增大时，二者的协同作用可使类黄酮提取率提高得更明显.但当料液比达到一定的比值时，类黄酮已基本溶出，其提取率不再提高；而当乙醇含量过高时，提取液的极性逐渐偏离类黄酮的极性，则影响类黄酮的提取率.

2.3验证试验

采用Design Expert 7.0软件求解回归方程，得到鼠曲草类黄酮提取的最佳工艺条件为：提取温度34.45 ℃、乙醇含量73.35%、超声波功率343.5 W、料液比1∶33，在此条件下类黄酮的提取率为15.32%.为便于实际操作，采用修正的优化组合条件，即提取温度35 ℃、乙醇含量73%、超声波功率350 W、料液比1∶35.采用修正条件进行验证试验，测得类黄酮提取率3次重复试验的平均值为15.25%，与理论值相对误差0.46%.经统计学分析，与同水平理论预测值无统计学差异(P>0.05)，表明与实际情况吻合，证明回归方程是可靠的，因此可用该回归方程代替真实点对试验结果进行分析和预测.

3结论与讨论

鼠曲草作为药食兼用的野生资源，在我国大部分地区均有分布，但目前对该资源的开发利用有限，尤其对其类黄酮提取方面的研究较少.本试验首次采用Box-Benhnken设计优化鼠曲草类黄酮超声波辅助提取工艺，结果表明该法操作方便、提取率高，且数据精确、科学可行，为鼠曲草资源的综合利用以及类黄酮产业化提供可靠依据.

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(责任编辑:施晓棠)

Optimization of ultrasound-assisted extraction of flavonoids fromGnaphliumaffineby Box-Benhnken Design

LIN Huating, LÜ Feng, HUANG Guochao

(College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Abstract:A four-factor-five-level Box-Benhnken Design was applied to optimize the parameters of ultrasound-assisted extraction of flavonoids from Gnaphlium affine D.Don. Basing on single factor experiments, extraction temperature, ethanol content, ultrasonic power and solid-liquid ratio were investigated. Results showed that the optimal ultrasound-assisted conditions of flavonoids were as follows: extraction temperature, 35 ℃; ethanol content, 73%; ultrasound power, 350 W; solid-to-liquid ratio, 1∶35. Under this condition and to be extracted for 50 minutes, the maximum extraction rate of flavonoid was 15.25%.

Key words:Gnaphlium affine; flavonoids; ultrasound-assisted extraction; optimization

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.01.016

中图分类号:TQ460.6+2

文献标识码:A

文章编号:1671-5470(2016)01-0094-07

作者简介:林华婷(1990-)，女，硕士.研究方向：食品化学与营养.Email：765694310qq.com.通讯作者吕峰(1964-)，女，教授，硕士生导师.研究方向：功能成分提取与天然产物的综合利用.Email：yongyi64@163.com.

基金项目:福建省自然科学基金资助项目(2012J01081).

收稿日期：2015-03-06修回日期：2015-05-13