AKT基因沉默对人卵巢癌细胞增殖及Fas、Fas L、Caspase-3蛋白表达的影响

刘曼，胡明英，王晓莉，李敏

(1潍坊医学院，山东潍坊261041；2潍坊市人民医院；3嘉祥县人民医院)



AKT基因沉默对人卵巢癌细胞增殖及Fas、Fas L、Caspase-3蛋白表达的影响

刘曼1，胡明英2，王晓莉1，李敏3

(1潍坊医学院，山东潍坊261041；2潍坊市人民医院；3嘉祥县人民医院)

摘要：目的观察丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)基因沉默对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖及细胞中Fas、FasL、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达的影响。方法 体外培养SKOV3细胞，随机分为对照组、空白载体组与实验组。空白载体组加入脂质体、不转染AKT siRNA，实验组转染AKT siRNA，对照组不给予任何干预措施。转染24 h后观察各组细胞增殖情况，采用免疫荧光双重标记法检测各组细胞中的Fas、FasL、Caspase-3蛋白。结果实验组细胞密度低于对照组、空白载体组，且细胞突起减少，胞体折光性减弱，细胞变圆离壁。实验组细胞密度为27.31%±1.22%，空白载体组、对照组分别为89.56%±2.17%、92.01%±3.22%，实验组与空白载体组、对照组相比，P均<0.05；实验组细胞增殖率为31.17%±1.38%，空白载体组、对照组增殖率分别为183.77%±4.22%、181.56%±3.77%，实验组与空白载体组、对照组相比，P均<0.01。实验组Fas、FasL、Caspase-3蛋白阳性表达率分别为18.62%±0.78%、85.69%±1.34%、74.22%±2.11%，空白载体组分别为14.01%±0.12%、58.67%±1.33%、43.24%±1.02%，对照组分别为16.06%±0.03%、32.77%±1.07%、38.01%±0.92%，实验组细胞中Caspase-3、FasL蛋白阳性表达率与空白载体组、对照组相比，P均<0.05。结论 AKT基因沉默后，SKOV3细胞增殖受到抑制，且细胞中FasL、Caspase-3蛋白表达上调。

关键词：卵巢癌；SKOV3细胞；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；Fas蛋白；FasL蛋白；RNA干扰技术

目前卵巢癌的治疗以手术、化疗、放疗为主，但疗效不理想，5年生存率在25%~30%[1]。RNA干扰(RNAi)技术通过短双链RNA(dsRNA)特异降解靶基因从而阻断靶基因表达，在肿瘤治疗方面有很好的应用前景[2]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路是参与细胞生长、增殖、分化调节的重要信号转导通路，与卵巢癌的发生发展密切相关[3，4]。2013年10月~2014年9月，我们设计并合成AKT基因的靶向siRNA，观察AKT基因沉默对卵巢癌细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白Fas、FasL、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达的影响，为卵巢癌的基因治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验材料人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3(上海中国科学院细胞库)，McCoy5A培养基(北京博润莱特公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(Trypsin，江苏碧云天生物技术研究所)，二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)，正常山羊血清工作液(北京中杉金桥公司)，TritonX-100(江苏碧云天生物技术研究所)，兔抗小鼠Fas单克隆抗体(武汉博士德生物公司)，小鼠抗山羊FasL单克隆抗体(武汉博士德生物公司)，小鼠抗山羊Caspase-3单克隆抗体(武汉博士德生物公司)，FITC标记的山羊抗小鼠IgG、FITC标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)。

1.2细胞培养与分组SKOV3细胞体外培养于含10%胎牛血清、90%的Mc-coy5A、青霉素100 μL/mL、链霉素100 μL/mL的培养基中，37 ℃、5%CO2培养。将细胞悬液以5×104/孔的密度接种于24孔板，培养24 h，当细胞融合80%~90%时进行转染。将细胞分为对照组、空白载体组、实验组。

1.3AKT siRNA的制备及转染化学合成靶向AKT的siRNA序列，由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成。AKT siRNA按说明书稀释配置。实验组加入AKT siRNA 与Lipofectamin2000混合液500 μL；对照组加入Mc-coy5A培养液500 μL；空白载体组加入只含Lipofectamin2000的Mc-coy5A培养液500 μL。各组转染6 h后更换完全培养液，继续培养24 h，然后进行检测。

1.4细胞增殖观察取各组已爬好片的24孔板，通过去培养基，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，激光共聚显微镜拍照。每个标本随机取10个视野，激光共聚显微镜下计数每个视野的细胞数，取平均值。用公式计算细胞密度及细胞增殖率：细胞密度=单位面积平均细胞数；细胞增殖率=单位面积平均细胞数/单位面积接种细胞数×100%。

1.5SKOV3细胞中Fas、FasL、Caspase-3蛋白检测取爬好片的24孔板，去培养基，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，含0.1%TritonX-100的PBS透膜30 min，PBS冲洗3次，进口山羊血清封闭液37 ℃下封闭30 min；弃封闭液，添加一抗(分别为兔抗Fas的一抗、小鼠抗FasL的一抗、小鼠抗活性Caspase-3的一抗)，4 ℃冰箱过夜；次日取出，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，分别避光滴加FITC标记的山羊抗小鼠及FITC标记的山羊抗兔荧光二抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次；DAPI封片，正置荧光显微镜拍照。计算阳性细胞百分比，0为阴性(-)、<25%为弱阳性(+)、25%~75%为中阳性(++)、>75%为强阳性(+++)。

2结果

2.1各组细胞增殖情况比较对照组、空白载体组细胞轮廓清晰，细胞突起明显，胞体折光度好。实验组细胞突起减少，胞体折光性减弱，细胞变圆离壁。见图1。实验组细胞密度为27.31%±1.22%,空白载体组、对照组分别为89.56%±2.17%、92.01%±3.22%，实验组与空白载体组、对照组相比，P均<0.05；实验组细胞增殖率为31.17%±1.38%，空白载体组、对照组增殖率分别为183.77%±4.22%、181.56%±3.77%，实验组与空白载体组、对照组相比，P均<0.01。

注：A为对照组；B为空白载体组；C为实验组。

图1各组细胞增殖情况

2.2各组细胞中Caspase-3、Fas、FasL蛋白表达比较实验组Fas、FasL、Caspase-3蛋白阳性表达率分别为18.62%±0.78%、85.69%±1.34%、74.22%±2.11%，空白载体组分别为14.01%±0.12%、58.67%±1.33%、43.24%±1.02%，对照组分别为16.06%±0.03%、32.77%±1.07%、38.01%±0.92%，实验组细胞中Caspase-3、FasL蛋白阳性表达率与空白载体组、对照组相比，P均<0.05。

3讨论

PI3K/AKT信号通路在肿瘤发生发展中发挥重要作用。在正常组织中PI3K/AKT信号通路处于活化状态，但如果被过度激活则可刺激蛋白质合成，抑制细胞凋亡，导致细胞无限增殖，进而引发肿瘤[5]。虽然关于PI3K/AKT信号通路的研究较多，但该通路在肿瘤发生及侵袭转移中的作用机制尚不明确[6]。近年来，基因治疗得到很大发展，即把正常基因或重组后的具有治疗作用的基因导入到异常细胞的DNA中，抑制致病、致癌基因的表达并修复缺陷及损伤基因[7]。目前，阻断PI3K/AKT信号通路已成为多种肿瘤治疗研究中的热点[8]。

RNAi技术可导致目的基因表达下调，选择性地沉默目的基因[9,10]。我们课题组通过RNAi技术沉默AKT基因表达[11]，观察干扰后卵巢癌细胞增殖及凋亡蛋白表达情况，分析卵巢癌基因治疗的机制[12]。Fas蛋白属于TNF受体家族，其配基为FasL[13]。Fas/FasL凋亡通路是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别和杀死肿瘤细胞、病毒感染细胞、衰老细胞的主要途径之一[14]。研究[15]表明，卵巢癌中Fas蛋白阳性表达率低于良性卵巢肿瘤，该蛋白表达增加可启动凋亡受体途径[16]。Caspase-3蛋白是Caspase家族中最重要的细胞凋亡相关蛋白，在细胞凋亡早期被激活。

本研究结果显示，实验组转染AKT siRNA后，细胞增殖受到抑制，FasL、Caspase-3蛋白阳性表达率增高，提示抑制AKT基因表达后，PI3K/AKT信号通路作用受到影响，激活细胞凋亡程序，抑制细胞增殖，这些作用可能与调节FasL、Caspase-3蛋白表达有关。关于沉默AKT基因表达后调控Fas蛋白表达、激活凋亡受体途径的具体机制，尚有待进一步研究。

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(收稿日期：2015-10-07)

中图分类号：R737.31

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)07-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.010

通信作者：胡明英(E-mail: humying001@sina.com)