Prx-1基因沉默对TGF-β1诱导肺成纤维细胞增殖、ROS水平、p-AKT蛋白表达的影响

刘宝欣，刘英宇，魏中秋，梁婷婷，范玉磊，杨方，孙影

(1华北理工大学附属唐山市工人医院，唐山063000；2华北理工大学基础医学院)



Prx-1基因沉默对TGF-β1诱导肺成纤维细胞增殖、ROS水平、p-AKT蛋白表达的影响

刘宝欣1，刘英宇1，魏中秋2，梁婷婷2，范玉磊2，杨方2，孙影2

(1华北理工大学附属唐山市工人医院，唐山063000；2华北理工大学基础医学院)

摘要：目的观察硫氧还原蛋白过氧化物酶1(Prx-1)基因沉默对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肺成纤维细胞增殖、活性氧簇(ROS)水平及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达的影响。方法 体外培养肺成纤维细胞MRC-5，并分为对照组、TGF-β1组、阴性转染组和实验组。阴性转染组和实验组分别通过脂质体Lipofectamine2000转染阴性对照siRNA及设计好的3个Prx-1 siRNA(Prx-1 siRNA-209、Prx-1 siRNA-289、Prx-1 siRNA-453)，培养48 h，real-time PCR法检测Prx-1 mRNA，选取转染Prx-1 siRNA-453的细胞用于后续实验。除对照组外，其余三组给予TGF-β1(5 μg/L)刺激。TGF-β1刺激24 h后，MTT实验观察细胞增殖情况，2,7-二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)实验检测ROS水平；TGF-β1刺激45min后，Western blotting法检测p-AKT蛋白。结果对照组、TGF-β1组、阴性转染组、实验组OD值分别为0.56±0.07、0.81±0.10、0.88±0.18、1.16±0.18，ROS水平分别为2 922±291、4 348±484、4 660±375、5 415±436；实验组细胞增殖情况及ROS水平与其余三组相比，P均<0.01；TGF-β1组、阴性转染组与对照组相比，P均<0.01。对照组、TGF-β1组、阴性转染组、实验组细胞中p-AKT蛋白相对表达量分别为0.45±0.05、0.60±0.07、0.57±0.07、0.77±0.09；实验组与其余三组相比，P均<0.01；TGF-β1组与对照组相比，P<0.01。结论 Prx-1基因沉默可增强TGF-β1对肺成纤维细胞的增殖诱导作用，上调细胞内ROS水平和p-AKT蛋白表达。

关键词：肺成纤维细胞；硫氧还原蛋白过氧化物酶1；基因沉默；转化生长因子β1；细胞增殖；活性氧簇；蛋白激酶B

肺成纤维细胞增殖是矽肺肺组织纤维化的重要原因之一，转化生长因子β1(TGF-β1)对肺成纤维细胞增殖有重要的促进作用[1]。TGF-β1可上调活性氧簇(ROS)水平，并由此激活C-Jun蛋白激酶(JNK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)等信号转导通路，促进矽肺纤维化[2，3]。最近研究表明，ROS激活蛋白激酶B (AKT)信号转导途径在细胞增殖中也发挥重要作用[4，5]。硫氧还原蛋白过氧化物酶1(Prx-1)可快速有效清除ROS，并抑制ROS介导的信号转导通路激活[6]。2015年1~7月，我们观察了Prx-1基因沉默对TGF-β1诱导肺成纤维细胞增殖、ROS水平及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达的影响，为Prx-1用于矽肺治疗提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验材料人胚胎肺成纤维细胞MRC-5，TGF-β1，兔抗人AKT抗体，兔抗人总AKT(T-AKT)和p-AKT抗体，兔抗人Prx-1抗体，Prx-1 siRNA及Prx-1上、下游引物，SYBR+Tap混合剂和M-MLV逆转录试剂盒，MTT试剂盒，活性氧检测试剂盒，酶联免疫检测仪，凝胶图像分析仪。

1.2Prx-1基因沉默方法及Prx-1 mRNA检测利用脂质体Lipofectamine2000将预先设计好的3个Prx-1 siRNA(Prx-1 siRNA-209、Prx-1 siRNA-289、Prx-1 siRNA-453)转染MRC-5细胞，培养48 h。TRIzol提取细胞总RNA，定量后取0.5 μg RNA行逆转录。取1 μL cDNA进行real-time PCR扩增。PCR反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。PCR结果示3个Prx-1 siRNA不同程度地降低了Prx-1 mRNA表达水平，其中转染Prx-1 siRNA-453者Prx-1表达水平最低，将Prx-1 siRNA-453用于后续实验。

1.3细胞培养与分组MRC-5细胞接种于含5%血清的DMEM培养基，5% CO2、37 ℃条件下常规培养。将MRC-5细胞分为四组，待MRC-5细胞融合至80%后开始实验。对照组给予0.4%血清继续培养；TGF-β1组给予0.4%血清培养12 h，使其同步化，然后给予TGF-β1(5 μg/L)刺激；阴性转染组加入脂质体Lipofectamine2000和阴性对照siRNA，孵育48 h后0.4%血清培养12 h，给予TGF-β1(5 μg/L)刺激；实验组加入脂质体Lipofectamine2000和Prx-1 siRNA-453，孵育48 h后0.4%血清培养12 h，给予TGF-β1(5 μg/L)刺激。

1.4MRC-5细胞增殖观察TGF-β1刺激24 h后(对照组于同一时间)弃培养液，每孔加入MTT 200 μL，继续孵育4 h，弃MTT，每孔加入DMSO 150 μL，摇床振荡10 min，495 nm波长测定吸光度(OD)值，以OD值代表MRC-5细胞增殖情况。

1.5MRC-5细胞内ROS检测采用2,7-二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)实验检测ROS。各组细胞TGF-β1刺激24 h后用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，加入DCFH-DA(终浓度为10 μmol/L)，37 ℃孵育20 min，PBS洗3次，计数1×104个细胞，用荧光酶标仪在激发波长488 nm、发射波长525 nm下测定细胞荧光强度，反映细胞内ROS水平。

1.6MRC-5细胞中p-AKT蛋白检测采用Western blotting法。各组细胞经TGF-β1刺激45 min后弃培养液，PBS洗涤。每组加入200 μL新鲜配制的细胞裂解液，冰上震荡裂解30 min，收集裂解细胞，12 000 r/min 4 ℃离心15 min，收集上清，-70 ℃保存备用。以考马斯亮蓝R-250染色测定蛋白浓度，以每孔20 μg上样，电泳并转膜。5%牛血清白蛋白37 ℃封闭1 h，T-AKT和p-AKT一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，BCIP/NBT显色3 min。用Image J软件进行灰度扫描及定量分析。以p-AKT与T-AKT灰度值之比作为p-AKT相对表达量。

2结果

2.1各组细胞增殖情况比较对照组、TGF-β1组、阴性转染组、实验组OD值分别为0.56±0.07、0.81±0.10、0.88±0.18、1.16±0.18；实验组与其余三组相比，P均<0.01；TGF-β1组、阴性转染组与对照组相比，P均<0.01。

2.2各组细胞内ROS水平比较对照组、TGF-β1组、阴性转染组、实验组ROS水平分别为2 922±291、4 348±484、4 660±375、5 415±436；实验组与其余三组相比，P均<0.01；TGF-β1组、阴性转染组与对照组相比，P均<0.01。

2.3各组细胞中p-AKT蛋白表达比较对照组、TGF-β1组、阴性转染组、实验组细胞中p-AKT蛋白相对表达量分别为0.45±0.05、0.60±0.07、0.57±0.07、0.77±0.09；实验组与其余三组相比，P均<0.01；TGF-β1组与对照组相比，P<0.01。

3讨论

ROS是细胞氧化系统中产生的含有活性氧功能基团的化合物，包括氧自由基、过氧化物和激发态氧等。病理状态下，过多ROS攻击细胞脂质、蛋白质和DNA导致细胞损伤[7]。ROS还参与细胞内信号转导通路，作为TGF-β1等多种细胞因子的第二信使，调节ERK1/2、JNK等信号转导途径，介导细胞增殖[2，3]。最近研究显示，ROS/AKT途径参与了肿瘤细胞和平滑肌细胞的增殖[4，5]。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，当AKT被激活时，其第308位苏氨酸和第473位丝氨酸发生磷酸化，并从细胞膜转移到细胞质和细胞核，激活或抑制下游靶蛋白，进而发挥调节细胞增殖、凋亡等作用[8~10]。本研究实验组在TGF-β1刺激24 h后，OD值较对照组增高，说明TGF-β1可诱导肺成纤维细胞增殖；同时TGF-β1组ROS水平及p-AKT表达较对照组增高，提示ROS/AKT通路激活在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖中发挥重要作用，与Wang等[11]的研究结果一致。

Prx-1是一种新型过氧化物酶，有强大的抗氧化能力，其结构中的过氧化半胱氨酸和可溶性半胱氨酸是清除H2O2的主要功能基团[12]。研究[13]显示，Prx-1可通过降低ROS调节细胞的生物学活性。有学者[14]发现，Prx-1与NADPH氧化酶在人动脉粥样硬化斑块巨噬细胞中表达位置相同，表达水平呈正相关关系，认为Prx-1不仅可在ROS产生的第一时间原位将其清除，而且对ROS敏感度高，是氧化应激的“感受器” 。另外，Prx-1还可抑制ROS介导的细胞内信号转导通路激活，如在β-拉帕醌(一种抗癌药)诱导的人宫颈癌细胞凋亡过程中，凋亡信号调节激酶(ASK1)通过激活JNK途径促进细胞凋亡，而Prx-1可通过促进TRX与ASK1结合从而抑制ASK1活性和细胞凋亡[15]。

我们前期研究发现，Prx-1可下调ROS水平进而抑制JNK和ERK1/2通路激活，缓解大鼠矽肺纤维化[2，3，16 ]。本实验利用Prx-1 siRNA转染肺成纤维细胞，沉默Prx-1基因表达，结果显示肺成纤维细胞增殖增强，ROS水平升高，p-AKT蛋白表达上调，提示Prx-1基因沉默后，ROS水平升高、AKT通路激活，二者在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖过程中发挥重要的促进作用。

结合上述研究结果，我们认为，Prx-1基因沉默可进一步增强TGF-β1对肺成纤维细胞的增殖诱导作用，上调细胞内ROS水平和p-AKT蛋白表达。

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Effects of silencing peroxiredoxin-1 gene on proliferation, ROS and p-AKT protein expression of pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1

LIUBaoxin1,LIUYingyu,WEIZhongqiu,LIANGTingting,FANYulei,YANGFang,SUNYing

(1TangshanWorkers′HospitalAffiliatedtoNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of silencing peroxiredoxin-1 (Prx-1) gene on the proliferation, reactive oxygen species (ROS) and phosphorylated AKT (p-AKT) protein expression of pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1. Methods The cultured MRC-5 pulmonary fibroblasts were randomly divided into 4 groups: control group, TGF-β1 group, negative transfection group and experimental group. The Prx-1 siRNA 3 sequences of Prx-1 siRNA (Prx-1 siRNA-209, Prx-1 siRNA-289, Prx-1 siRNA-453) were transfected into the negative transfection group and experimental group by Lipofectamine2000, respectively. After culturing for 48 h, Prx-1 mRNA was detected by real-time PCR to evaluate transfection and Prx-1 siRNA-453 was selected to be used later. Except for the control group, the other three groups were co-cultured with TGF-β1 (5 μg/L). Cell proliferation was detected by MTT assay and reactive oxygen species (ROS) level was detected by DCFH-DA assay after 24 h of TGF-β1 stimulation. p-AKT expression was detected by Western blotting after 45 min of TGF-β1 stimulation. Results The OD was respectively 0.56±0.07, 0.81±0.10, 0.88±0.18 and 1.16±0.18 in the control group, TGF-β1 group, negative transfection group and experimental group, and the levels of ROS were 2 922±291, 4 348±484, 4 660±375 and 5 415±436, respectively. Significant difference were found in the levels of ROS and OD between the experimental group and the other three groups (all P<0.01). The p-AKT expression of the control group, TGF-β1 group, negative transfection group and experimental group was 0.45±0.05, 0.60±0.07, 0.57±0.07 and 0.77±0.09, respectively. The expression of p-AKT in the experimental group was the highest in all groups (all P<0.01). The p-AKT expression of the TGF-β1 group was higher than that of the control group (P<0.01). Conclusion Silencing Prx-1 gene can enhance the proliferation of pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1, and up-regulate the level of ROS and p-AKT protein expression in the cells.

Key words:lung fibroblasts; peroxiredoxin; gene Silencing; transforming growth factro-β1; cell proliferation; reactive oxygen species; protein kinase B

(收稿日期：2015-11-08)

中图分类号：R563.9

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)07-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.006

通信作者简介：孙影(1976-)，女，博士，副教授，主要研究方向为矽肺的基础研究。E-mail: 1565756268@qq.com

作者简介：第一刘宝欣(1974-)，女，副主任医师，主要研究方向为慢阻肺的基础和临床。E-mail: syzxp@sina.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81072254)；唐山市科学技术研究与发展项目(14130275B)。