10种中草药提取物对烤烟白粉病菌的抑制活性

周建云，刁朝强＊，廖 勇，谭 建，黄 宁，聂忠扬，桑维钧，石春发

（1．贵州省烟草公司贵阳市公司，贵州贵阳550002；2．贵州大学，贵州贵阳550025）

10种中草药提取物对烤烟白粉病菌的抑制活性

周建云1，刁朝强1＊，廖 勇1，谭 建1，黄 宁1，聂忠扬1，桑维钧2，石春发2

（1．贵州省烟草公司贵阳市公司，贵州贵阳550002；2．贵州大学，贵州贵阳550025）

为有效挖掘植物源杀菌剂资源，以烤烟白粉病菌为供试菌种，采用菌丝生长速率法研究10种中草药提取物的抑制活性，并在此基础上选取抑菌活性较强的几种提取物进行毒力测定。结果表明：10种中草药通过3种提取法得到的提取物均对烤烟白粉病菌有抑制作用。其中，蛇床子醇提物的抑制率最高，达100%；其次是蛇床子盐提物和黄药子水提物，分别为94．36%和87．57%。蛇床子醇提物、蛇床子盐提物和肉豆蔻醇提物的室内毒力EC50分别为57．54mg／L、110．00mg／L和225．39mg／L，以蛇床子醇提物的抑制效果最佳。

白粉病；中草药；提取物；毒力测定

近几年，白粉病已成为贵阳烟区危害烤烟的主要病害之一，其大量发生导致减产甚至绝收，给烟农造成巨大的经济损失。该病在苗期和大田前期有零星发生，每年6—7月烤烟正处于旺长期前后，如遇阴雨寡照天气，白粉病将大量爆发且很快流行蔓延［13］，烤烟下部叶甚至中部叶感染白粉菌，轻则降低烟叶品质，重则失去烘烤价值。采烤的发病叶片在调制过程中病斑仍会继续扩大，叶片薄如纸状易破碎呈糊片，缺乏弹性，丧失经济价值［4］。

防治烤烟白粉病常用方法有选育抗病品种、改进栽培措施及化学农药防治。目前，国内烤烟品种对白粉病抗性较弱，化学农药防治虽见效快、价格低，但农药残留将对烟叶品质安全造成严重影响。生物杀菌剂多为微生物和植物源杀菌剂，其中，微生物杀菌剂主要有农用抗生素、细菌杀菌剂、真菌杀菌剂和病毒杀菌剂等［5－8］；植物源杀菌剂则采用植物汁液、干粉、提取物或经分离得到的有效成分制成具有农药活性的制剂［9－11］，其使用对人畜安全、无污染、低毒、低残留，因此，生物农药已成为农药领域研究的热点，植源杀菌剂也越来越为人们所重视。目前，采用中草药提取植物源杀菌剂防治白粉病的研究已有文献报道［12－16］，主要集中于黄瓜等作物的白粉病防治，未见植物源杀菌剂防治烤烟白粉病的研究报道。为有效挖掘防治烤烟白粉病菌的植物源杀菌剂资源应用于烤烟生产，笔者采用菌丝生长速率法研究10种中草药不同提取法（盐提法、醇提法和水提法）提取物的抑制活性，并在此基础上选取抑菌活性较强的几种提取物进行毒力测定。

1材料与方法

1．1供试材料

1．1．1中药材10种中药材原料（表1），从贵阳市中药材市场采购。

1．1．2病原菌 烤烟白粉病菌（Powdery mildew）采自贵阳主产烟区感染白粉病的烟株，经接种保存于贵州大学植物病理教研室恒温培养箱。

表1 10种供试中草药名录及提取部位Table 1 List and extracted part of the ten tested herbal medicines

1．1．3化学药剂15%三唑酮WP，四川迪美生物科技有限公司生产。

1．1．4培养基及其他 水琼脂培养基（20g琼脂粉＋1 000mL水），60mm培养皿、无菌水、无菌操作台、电子天平、药管、高压灭菌锅及移液枪等。

1．2试验方法

1．2．1中草药提取物提取方法 取中草药10g浸泡于45mL装好水、生理盐水或无水乙醇等带塞的250mL灭菌锥形瓶中（稀释10倍，原药浓度以0．1 g／mL计），置于恒温水浴摇床中进行震荡，至药剂完全混合后（约60min），离心5min（5 000转／min），用4层灭菌纱布将上清液过滤，并置于灭菌试管中备用。

1．2．2试验设计1）提取物对烤烟白粉病菌孢子萌发的影响。真菌孢子萌发试验（水琼脂法）。将配制好的水琼脂培养基置入60mm培养皿中制成平板，将10种中草药提取物配制成400×液，用移液枪分别吸取每种提取物1mL浸渍于对应培养皿平板（保持平板湿润）后接种烟草白粉菌分生孢子，将培养皿封闭好放置于25℃的光照培养箱中（12h光照、12h黑暗）培养24h，然后用10×10倍显微镜观察计数，以孢子芽管长度大于分生孢子宽作为萌发标准，每个处理重复3个以上视野，调查孢子萌发数，总数不得少于200个。分别记录萌发数和调查孢子总数，计算孢子萌发率（R）。

式中，Ng为孢子萌发数，Nt为调查孢子总数。

2）提取物对烤烟白粉病菌的毒力测定。选取白粉菌孢子萌发率最低的几种中草药提取物，即抑制效果较好的提取物进行不同浓度毒力测定，从中筛选最佳浓度，为大田试验示范提供基础依据。将其配制成50mg／L、100mg／L、250mg／L、500mg／L和1 000mg／L 5个浓度，用移液枪分别吸取每个浓度提取物1mL浸渍于对应培养皿平板后接种烟草白粉菌分生孢子，将培养皿封闭好放置于25℃的光照培养箱中（12h光照、12h黑暗）培养24h，然后用10×10倍显微镜观察计数。其余步骤同上。分别记录萌发数和调查孢子总数，计算孢子萌发率、校正孢子萌发率和孢子萌发相对抑制率。将孢子萌发抑菌率转换成抑菌几率值（y），杀菌剂质量浓度转换成对数值（x），根据杀菌剂质量浓度对数与抑菌几率值，采用回归法求得不同杀菌剂对供试菌株的毒力回归方程y＝ax＋b，并计算毒力回归方程相关系数r和EC50。

式中，Re为处理校正孢子萌发率，Rt为处理孢子萌发率，R0为空白对照孢子萌发率，I为孢子萌发相对抑制率。

1．3数据统计与分析

数据采用Excel和SPSS软件进行统计分析。

2结果与分析

2．1 10种中草药提取物对烤烟白粉病菌孢子萌发的抑制效果

从表2可知，10种中草药不同提取法提取物对烤烟白粉病菌均有不同程度的抑制作用。

1）盐提法。10种中草药盐提取物对烤烟白粉病菌孢子萌发均存在不同程度的抑制作用。其中，蛇床子盐提取物的萌发率最低，仅5．64%；其次是白术，为11．25%；第3是肉豆蔻，为12．43%。萌发率超过15%的有6种，以益母草最高，为34．69%。表明，蛇床子、白术及肉豆蔻盐提取物对烤烟白粉病菌的抑制效果较好。

2）醇提法。10种中草药醇提取物对烤烟白粉病菌孢子萌发均存在不同程度的抑制效果。其中，蛇床子醇提取物的萌发率最低，为0；其次是肉豆蔻，为4．19%；第3是白术，为12．41%。萌发率超过15%的有7种，以益母草最高，为48．38%。表明，蛇床子、白术及肉豆蔻醇提取物对烤烟白粉病菌的抑制效果较好。

3）水提法。10种中草药水提取物对烤烟白粉病菌孢子萌发均存在不同程度的抑制效果。其中，黄药子水提取物的萌发率最低，为12．43%；其次是白术和肉豆蔻，均为13．83%；第3是蛇床子，为14．30%。萌发率超过15%的有6种，以益母草最高，为25．31%。表明，黄药子、蛇床子、白术及肉豆蔻水提取物对烤烟白粉病菌的抑制效果较好。

综上可知，10种中草药不同提取物400×稀释液，除蛇床子盐提取物、蛇床子醇提取物和肉豆蔻醇提取物萌发率小于或接近5%外，其余提取物的萌发率均高于10%。因此，选取此3种提取物进一步进行白粉病菌抑制作用及室内毒力测定。

2．2不同浓度中草药提取物对烤烟白粉病菌孢子的毒力测定

由表3可知，不同浓度提取物通过空白对照校正后均对白粉病菌孢子萌发存在不同程度的抑制作用，且随着浓度增加3种提取物对孢子萌发抑制作用增强。其中，3种提取物浓度为1 000．0mg／L时，其白粉病菌孢子萌发率分别为7．65%、5．51% 和3．42%。

表2 10种中草药不同提取法提取物处理烤烟白粉病菌孢子的萌发率Table 2 Germination rate of tobacco powdery mildew spores treated with ten herbal medicine extracts by different extraction methods

由表4可知，蛇床子盐提物浓度为50．0～1 000．0mg／L时，其抑制率为42．19%～92．35%；相同浓度下，蛇床子醇提物的抑制率为75．20%～94．40%，肉豆蔻醇提物的抑制率为67．01%～96．58%。表明，蛇床子醇提物随浓度提高其抑制率增幅最小，其次为肉豆蔻醇提物，蛇床子盐提物的增幅最大。采用回归法得3种提取物对烤烟白粉病菌的毒力回归方程分别为y蛇床子盐提物＝2．475 3＋1．236 7x、y蛇床子醇提物＝3．7 1 3 6＋0．7 3 0 9 x和y肉豆蔻醇提物＝0．230 3＋2．027 2x，其相关系数均达0．9以上，表明，各浓度与孢子萌发率呈较好的线性关系。3种提取物的EC50依次为醇提蛇床子（57．54mg／L）＜盐提蛇床子（110．00mg／L）＜醇提肉豆蔻（225．39mg／L）。

表3 3种中草药提取物不同浓度处理烤烟白粉病菌孢子的萌发率Table 3 Germination rate of tobacco powdery mildew spores treated with different concentrations of the three herbal medicine extracts

表4 3种中草药提取物不同浓度对烤烟白粉病菌的毒力Table 4 Toxicity of various concentrations of three herbal medicine extracts against tobacco powdery mildew

3结论与讨论

10种中草药不同提取法提取物对烤烟白粉病菌均有不同程度的抑制作用。其中，盐提取物以蛇床子的抑制效果最好，抑制率达94．36%；其次为白术，达88．75%；醇提取物以蛇床子的抑制效果最好，抑制率达100%；其次是肉豆蔻，达95．81%；水提取物以黄药子抑制效果最好，抑制率达87．57%；其次为白术和肉豆蔻，均达86．17%。

试验选取抑制率在95%左右的蛇床子盐提取物、蛇床子醇提取物和肉豆蔻醇提取物等3种提取物进行室内毒力测定，随着提取物浓度的提高，抑制率均有所提高。其中，以蛇床子醇提物的毒力最高，其EC50为57．54mg／L。3种提取物建立的毒力方程其相关系数均达0．9以上，表明各浓度与孢子萌发率呈较好的线性关系。

该试验结果仅为室内毒力测定效果，不能完全代表对烤烟白粉病菌的抑制作用，还需进行田间活体烟株防治试验加以验证。但本次试验筛选的结果对防治烤烟白粉病菌提供了理论依据，也为今后进一步筛选中草药防治白粉病奠定了基础。

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（责任编辑：王 海）

Inhibitory Activity of Ten Herbal Medicine Extracts Against Powdery Mildew of Flue－cured Tobacco

ZHOU Jianyun1，DIAO Chaoqiang1＊，LIAO Yong1，TAN Jian1，HUANG Ning1，NIE Zhongyang1，SANG Weijun2，SHI Chunfa2

（1．Guiyang Branch Compangy，Guizhou Tobacco Company，Guiyang，Guizhou550002；2．Guizhou University，Guiyang，Guizhou550025，China）

For excavating botanical fungicide resources effectively，the inhibition activity of ten herbal medicine extracts was studied by mycelial growth rate method with tobacco powdery mildew as the test object，on this basis，the toxicity test of some extracts with stronger inhibition activity was conducted．Results：All the ten herbal medicine extracts with three different extraction methods inhibited tobacco powdery mildew．The inhibition rate of alcohol extract of Cnidium monnieri was the highest（100%），followed by salt extract of C．monnieri and water extract of Dioscorea bulbifera（94．36%and 87．57% respectively）．The indoor toxicity EC50of alcohol extract of C．monnieri，salt extract of C．monnieri and myristyl alcohol extract were respectively 57．54mg／L，110．00mg／L and 225．39mg／L．Alcohol extract of C．monnieri was of the best inhibition effect．

powdery mildew；herbal medicine；extracts；toxicity test

S572．435；S482．2＋92

A

1001－3601（2016）11－0465－0065－04

2016－09－28；2016－10－19修回

中国烟草总公司贵州省公司项目“贵阳市烟草白粉病防控体系建设与技术集成研究”（201309）

周建云（1980－），男，农艺师，从事烤烟营养研究与推广工作。E－mail：zhhee2005＠126．com

＊通讯作者：刁朝强（1968－），男，高级农艺师，从事烤烟生产技术研究与推广工作。E－mail：dcq2120＠163．com