昆明动物园圈养长臂猿粪便可培养细菌分析

李 莲 马国强 刘 丽 刘安荣 师 婧 周杰珑 王秀艳

（1.西南林业大学生命科学学院，云南昆明650224；2.国家林业局昆明勘察设计院，云南昆明650216；3.西南林业大学林学院，云南昆明650224；4.昆明动物园，云南昆明650224）

昆明动物园圈养长臂猿粪便可培养细菌分析

李 莲1马国强2刘 丽3刘安荣4师 婧4周杰珑1王秀艳1

（1.西南林业大学生命科学学院，云南昆明650224；2.国家林业局昆明勘察设计院，云南昆明650216；3.西南林业大学林学院，云南昆明650224；4.昆明动物园，云南昆明650224）

以昆明动物园7只圈养长臂猿为研究对象，通过传统微生物检测和分子生物学方法相结合，对其新鲜粪便可培养细菌进行分离、鉴定与分析。结果表明：分离得到的15株细菌中，有9株细菌可鉴定到种，分别属于甲基营养型芽孢杆菌、海氏肠球菌、耐盐短杆菌和弗氏志贺菌4个种；有6株细菌可以鉴定到属，分别属于奈瑟菌属和大肠杆菌2个属；其中优势菌为耐盐短杆菌和大肠杆菌。

长臂猿；粪便；细菌；优势菌；动物园

长臂猿作为我国国家一级保护动物，与黑猩猩（Pan trog lodytes）、猩猩（Pongo pygmaeus）和大猩猩（Gorilla beringei）同属类人猿。虽然我国政府在20世纪80年代初设立多个保护区对长臂猿进行保护，但保护现状不容乐观。目前我国的长臂猿保护工作迫在眉睫。白掌长臂猿（Hylobates lar）可能已经从中国消失；东黑冠长臂猿（Nomascus nasuts）和海南长臂猿（Nomascus hainanus）的数量均不足30只，已接近灭绝边缘；东白眉长臂猿（Hoolock leuconedys）数量不足200只；即使是数量最多的西黑冠长臂猿（Nomascus concolor），也仅有1 000多只［1］。在迁地保护中，患病死亡是长臂猿数量减少一个不可忽视的因素，人工圈养常出现长臂猿幼子腹泻致死的情况，且这种情况一旦发生，无法治愈。究其原因，可能是关于长臂猿的肠道微生物群落的结构和组成还有待了解，当遇到肠道菌群紊乱导致腹泻时，一味地采用家养动物的治疗方式和药物，达不到“对症下药”，自然就无疗效可言。在对动物肠道菌群研究中，常规方法容易忽略了不可培养微生物，分析时往往低估了肠道菌群的多样性，很难全面反映肠道菌群的结构特征［2-3］。

近年来，基于16S rRNA建立的一系列分子生物学分析方法，对多种动物肠道微生物的分析研究已有报道，但关于传统方法与分子生物学结合对长臂猿肠道微生物群落结构和系统进化方面的研究较少。为此，本研究通过对昆动物园7只长臂猿鲜粪便进行可培养细菌鉴定与分析，初步分清种类和数量，确定优势菌。研究结果可为今后其健康状况监测，以及肠道微生态制剂等深入研究提供参考，为指导长臂猿等野生动物正确防治腹泻类肠道疾病方面提供借鉴，提高迁地保护成效。

1 材料与方法

1.1 试验动物来源

长臂猿7只，由昆明动物园饲养，具体情况见表1。

表1 昆明动物园长臂猿情况Tab.1 Gibbons cases in Kunming zoo

1.2 试验试剂

营养琼脂培养基、LB培养基、EC培养基，均参照文献［4］准备；革兰氏染色液、MR试剂、VP试剂等均按常规方法配制；基因组DNA快速提取试剂盒，蛋白酶K，琼脂糖等购自北京百泰克生物有限公司；Tris-base，EDTA，冰乙酸，无水乙醇等常规试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 采样 粪便采集时间为春夏秋3个季节的早、中、晚，每个季节采样2次。每次采集时均用灭过菌的竹签或是筷子取新鲜粪便20 g立刻装入无菌采样袋中，放入装有冰袋的采样盒保存，于30 min内运回实验室进行样品的稀释、培养等处理。

1.3.2 稀释与培养 将采集的样品称5 g放入装有45mL稀释液的锥形瓶中，并放入摇床上30min，37℃，稀释度为10-1。从锥形瓶中吸取样品100μL注入盛有900μL无菌水的离心管中，吹打均匀。重复以上步骤，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等各种稀释度。

分别吸取15μL 10-4、10-5、10-6稀释后的菌液放入配置好的LB培养基和NA培养基上，并用涂布棒涂布均匀；分别吸取15μL 10-3、10-4、10-5稀释后的菌液放入配置好的EC培养基上，并用涂布棒涂布均匀。每种培养基上接种3个培养皿，并设1个空白对照。所有操作均在超净工作台上进行，涂布完成后在37℃恒温培养箱中培养24 h。

1.3.3 计数 取菌落数在30～300个的平板进行计数，若只有1个稀释度的菌落数符合此范围，即以该菌落数记录；若有2个稀释度的菌落数符合，则由两者菌落数的比值来决定，比值≤2应记录其平均数，若＞2则记录其中菌落数较少的值；若3个稀释度的菌落数均为30～300个，则样品应重新进行稀释培养，直至只有1个或2个稀释度菌落数在此范围内；若所有稀释度的菌落数均＞300个，则按稀释度最高的菌落数记录；若所有稀释度的菌落数均＜30个，则按稀释度最低的菌落数记录；若所有稀释度的菌落数均不在30～300个之间，其中1个稀释度＞300个，而相邻的另一稀释度＜30个，则以接近30个或300个的菌落数记录。

1.3.4 细菌分离与鉴定

1）细菌分离。根据细菌计数试验平板中菌落的生长表现，即菌落的大小、形状、颜色、边缘、表面隆起、光滑度、透明度等性状，将相同的菌落归为一类，并统计出该菌落在所有样品中出现的次数，由此确定优势菌。并从平板中挑取各典型生长的菌落进行纯培养。

2）细菌染色鉴定。对分离的细菌纯培养物首先进行革兰氏染色镜检，观察细菌的形状、大小等革兰氏染色特征，再用芽胞染色法，鞭毛染色法观察细菌的芽胞、鞭毛，对分离细菌作出初步鉴定和分类。

3）细菌生化鉴定。根据上述初步鉴定结果，针对不同的菌株选择相应的生化试验项目进行生化反应试验，最后查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》将细菌鉴定到属、种［5］。

1.3.5 16S rDNA序列分析 对生理生化鉴定的可疑菌株进行16S rDNA序列分析［6］，即进行PCR扩增目的片段，产物送上海杰李生物技术有限公司测序，然后在EzBioCloud中的微生物核酸基因库中进行比对，确定细菌菌株种属关系。细菌16S rDNA通用引物为：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’（引物送上海生工合成）。

1）细菌16S rDNA提取。取0.5～2.0 m L培养菌液，按北京百泰克公司的基因组DNA快速提取试剂盒操作说明书提取细菌基因DNA.

2）PCR扩增。在超微量核酸蛋白测定仪（Namedrop ND-2000）测定DNA浓度后，选取适合的样品作为模板，用细菌16S rDNA通用引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL，其中2×Master Mix 25μL，上下游引物各1.5μL，模板3μL，加水补足至50μL。PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃45 s，57℃45 s，72℃2 min，35个循环；72℃延伸5min。PCR结束后，取5μL产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，30 min后于凝胶成像系统观测结果。

2 结果与分析

2.1 菌落特征

从长臂猿粪便中分离出的细菌在不同培养基中形成的菌落外观形态差异不大，均是菌落边缘整齐，湿润光滑，仅颜色有细微差别。如在NA培养基中形成的菌落颜色呈白色，在LB培养基上形成的菌落透明稍带些许黄色，而在EC培养基中形成的菌落颜色则呈乳白色。

各培养基对照组上均无菌落生长，从而排除了在试验操作和培养过程中被污染的可能性。从以上不同培养基上挑取各典型生长的菌落，在相应的培养基上进行反复划线分离，直到获得纯菌株，最终得到15株。

2.2 显微鉴定

对15株分离细菌的纯培养物进行显微鉴定，包括革兰氏染色、芽孢染色及荚膜染色，染色结果见表2。

从表2可以看出，长臂猿粪便中分离得到的细菌以杆菌为主，排列形式有单个排列，成对排列，还有成对排列呈弧状的菌株，分离得到的菌株仅有CBY-2为球菌，分离菌株的显微结构见图1。

另外，得到的15株细菌中，除CBY-1及CBY-5有芽孢，其余菌株的染色结果均没有发现芽孢。所有菌株均没有发现存在荚膜。

表2 分离菌株染色鉴定Tab.2 Identification of isolated strain

2.3 生化鉴定

选取有代表性的15株分离菌的纯培养物进行各项生化试验，鉴定结果见表3。

表3 各分离菌株生化鉴定结果Tab.3 Biochemical identification results of different isolates

由表3可知：菌株CBY-4，CBY-5利用糖的特性以及甲基红试验，吲哚试验结果等特征相似，可初步确认为属同一菌属。另外CBY-6、CBY-7、CBY-8、CBY-9及CBY-10利用糖的特性和各生化特征也基本一致，也可将其初步归为同一类菌。其他8株菌株的生化特征存在差异，可能分属为不同的菌种。

2.4 分子鉴定与分析

2.4.1 细菌16S rDNA的PCR扩增 利用细菌通用引物27（F）和1492（R）进行粪便细菌16S rDNA PCR扩增，CBY1～CBY13结果均得到预期的1 500 bp单一扩增条带，结果见图2。

2.4.2 细菌16S rDNA序列分析 扩增产物测序后，通过DNAMAN拼接，然后提交到EzTaxon（http：//www.ezbiocloud.net/）进行16S rDNA在线比对，结果见表4。

一般认为，相似度大于99%的细菌判定为同种细菌，相似度为95%～99%则判定为同属，相似度在91%～95%判定为同科［7］。

表4 细菌16S rDNA比对结果Tab.4 Results of rDNA 16S

从表4可以看出，15株细菌，有9株细菌可鉴定到种，分别属于甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）、海氏肠球菌（Enterococcus hirae）、耐盐短杆菌（Brevibacterium halotolerans）和弗氏志贺菌（Shigella flexneri）4个种；另外6株细菌则可分别属于奈瑟菌属（Neisseria）和埃希氏菌属（Escherichia）2个属。

2.5 优势菌分析

通过菌落计数，确定优势菌群，结果见表5。

从表5可以看出：长臂猿粪便分离出的菌株数量由高到低依次为耐盐短杆菌、埃希氏菌属菌、奈瑟菌属菌、弗氏志贺菌、甲基营养型芽孢杆菌，最后为海氏肠球菌，其中优势菌群为耐盐短杆菌和大肠杆菌，分别占可培养细菌的50.52%和40.07%。

表5 长臂猿粪便可培养细菌分离比例Tab.5 The segregation ratio of gibbons fecal bacteria

3 结论与讨论

关于长臂猿肠道细菌的研究前人工作较少，国外只有少数几篇相关报道，如L.D.Banish等对灵长类动物肠道病原体中的痢疾菌-志贺氏菌进行了报道研究，发现试验中的长臂猿均有所感染［8］；Depaliand等对长臂猿死因研究中发现类圆线虫病能引起其腹泻［9］。国内李婉平等对广州动物园一例水样泻致死的白眉长臂猿进行剖检发现其存在溶组织阿米巴感染［10］。施新泉等发现有长臂猿感染司氏伯特绦虫病［11］。刘燕等从一白颊长臂猿体内分离得到1株肺炎克雷伯氏菌［12-13］。李达等研究发现贵州一野生动物园长臂猿存在有流感病毒，支原体及巴氏杆菌的混合感染［14］。杨云飞等从一慢性腹泻的白眉长臂猿粪便中分离得到1株肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种和1株致病性大肠杆菌［15］，且证实了长臂猿腹泻正是由于这2种菌混合感染引起的。

本试验依据可培养细菌菌落特征、染色特性和显微形态观察，以及结合16S rDNA序列分析等方法［16］，从核酸的角度揭示了长臂猿肠道细菌的多样性。对昆明动物园7只健康长臂猿粪便可培养细菌的研究发现，革兰氏阳性菌数量多于革兰氏阴性菌，共计分离出耐盐短杆菌、大肠杆菌、奈瑟菌、弗氏志贺菌、甲基营养型芽孢杆菌、海氏肠球菌共6种。与杨云飞等分离得到肺炎克雷伯氏菌和致病性大肠杆菌有一定差异。也许是因为杨云飞等是从正在腹泻的长臂猿粪便中分离得到的，与本试验采集的没有病症的长臂猿粪便有一定差异。从本试验结果来看，一些肠道菌群常见菌未能检出，可能与该试验所选用的培养基和培养方法有关，但在一定程度上，该结果仍可作为长臂猿肠道菌群数值的参考。

［1］ 范朋飞.中国长臂猿科动物的分类和保护现状［J］.兽类学报，2012，32（3）：248-258.

［2］ 郭海勇，吴静，许磊，等.16S rRNA基因序列在动物消化道细菌鉴定中的应用［J］.安徽农业科学，2008，36（17）：7152-7154.

［3］ 冯霞，殷幼平，王中康.现代分子生物学技术在动物肠道微生物多样性研究中的应用［J］.应用与环境生物学报，2005，11（3）：381-387.

［4］ 陈天寿.微生物培养基的制造与应用［M］.北京：中国农业出版社，1995.

［5］ 布坎南R E.伯杰细菌鉴定手册［M］.北京：科学出版社，1984：382-462.

［6］ 阮期平.新编生物实验技术手册［M］.重庆：西南交通大学出版社，2010：130-134.

［7］ 张志和，何光昕，张安居，等.大熊猫肠道正常菌群的研究［J］.兽类学报，1995，15（3）：170-175.

［8］ Banish L D，Sims R，Sack D，et.al.Prevalence of shigellosis and other enteric pathogens in a zoologic collection of primates［J］.Am Vet Med Assoc，1993，203（1）：126-132.

［9］ Depaliand A，Johnsen D O.Fatal strongy loidiasis is gibbons（Hylobates lar）［J］.Vct pathol，1978，15：31-39.

［10］ 李婉平，王兴金，陈足金，等.白眉长臂猿肠阿米巴病例［J］.中国兽医杂志，2002，38（9）：49.

［11］ 施新泉，周忠勇，丘博生.白眉长臂猿司氏伯特绦虫病病例［J］.中国兽医杂志，1988，14（3）：33-34.

［12］ 刘燕，赵京，张成林.肺炎克雷伯氏菌致白颊长臂猿脓肿一例［J］.野生动物，2011，32（3）：156-157.

［13］ 陈永林，赵京，张成林，等.长臂猿克雷伯氏菌病病原鉴定［J］.中国兽药杂志，2007，41（10）：58-59.

［14］ 李达，汤德元，曾智勇，等.贵州某野生动物园长臂猿流感病毒、支原体及巴氏杆菌混合感染的诊治［J］.中国畜牧兽医，2015，42（1）：224-229.

［15］ 杨云飞，赵沁坤，杨玉钊，等.一例白眉长臂猿慢性腹泻的诊治及病原分离鉴定［J］.云南畜牧兽医，2004（3）：5-6.

［16］ Ishikawa M，Ishizaki S，Yamamoto Y，et al.Paraliobacillus ryukyuensis gen.nov.sp.nov.a new Gram-positive，slightly halotolerant，faculantative anaerobe isolated from a decomposingmarine alga［J］.Journal of General Applied Microbiology，2002，48（5）：269-279.

（责任编辑 张 坤）

Research and Analysis of Cultivate Bacteria in Captive Gibbons Faeces in the Kunming Zoo

Li Lian1，Ma Guoqiang2，Liu Li3，Liu Anrong4，Shi Jin4，Zhou Jielong1，Wang Xiuyan1
（1.College of Life Science，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；2.Chian Forest Exploration&Design Institute on Kunming，Kunming Yunnan 650216，China；3.College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；4.Kunming Zoo，Kunming Yunnan 650224，China）

It took seven captive Gibbons of Kuming Zoo as the research object，adopted a combination of traditionalmicrobiological and molecular biologicalmethods，isolated，identified and analyzed the cultivate bacteria of fresh feces.The results showed that nine strains could identify to spicies among the 15 isolated strains of bacteria，which were belonged to Bacillusmethylotrophicus，Enterococcushirae，Brevibacterium halotolerans and Shigella flexneri 4 species，respectively.The other six strains could identify to genus，which were belonged to the genus Neisseria and Escherichia coli2 genus，respectively.Which the brevibacterium halotolerans and Escherichia coli were the dominantbacteria.

gibbons；faeces；bacteria；dominant bacteria；zoo

S718.6

A

2095-1914（2016）02-0121-06

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.02.020

2015-10-12

云南省生物学优势特色重点学科建设项目（50097505）资助；林下生物资源保护与利用科技创新团队建设项目（51400605）资助。

第1作者：李莲（1990—），女，硕士生。研究方向：动物疫原疫病。Email：15008189120@163.com。

周杰珑（1976—），男，副教授，硕士生导师。研究方向：动物繁殖与疾病研究。Email：zhjiel@163.com。