不同厂家口炎清产品中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量比较

姚小华，匡艳辉，张一凡，张晓燕

(广州白云山和记黄埔中药有限公司，广东 广州 510515)



不同厂家口炎清产品中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量比较

姚小华，匡艳辉，张一凡，张晓燕

(广州白云山和记黄埔中药有限公司，广东 广州 510515)

目的 研究不同厂家口炎清的质量情况，为提高药品标准、正确评价药品质量提供理论依据。方法 采用高效液相色谱(HPLC)法对4个厂家生产的10批口炎清中的主要成分绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的质量分数进行测定，色谱柱为Waters XBridgeTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为30 ℃，流速为1 mL/min；流动相为乙腈-0.4%(体积分数)醋酸(梯度洗脱)，绿原酸采用二极管阵列检测器(PDAD)检测，检测波长为330 nm，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙用蒸发光散射检测器(ELSD)检测，检测条件：雾化室温度60 ℃，漂移管温度65 ℃，N2的载气流量1.6 L/min，进样量8 μL。结果 不同厂家口炎清产品中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙质量分数差别较大。口炎清颗粒剂的质量相比胶囊剂和片剂较好；口炎清胶囊中不但灰毡毛忍冬皂苷乙质量分数非常低，而且检测不到川续断皂苷乙；口炎清片样品中灰毡毛忍冬皂苷乙的质量分数却异常高。结论 不同厂家的口炎清产品由于原材料质量、制剂工艺等不同，导致了产品中有效成分的质量分数存在较大差异。

口炎清； HPLC法； 绿原酸； 灰毡毛忍冬皂苷乙； 川续断皂苷乙

口炎清颗粒是由山银花、天冬、麦冬、玄参、甘草5味中药组成的复方制剂，具有滋阴清热、解毒消肿之功效，用于阴虚火旺所致的口腔炎症，现行2015年版《中国药典》一部收载的口炎清颗粒标准中只对单一成分绿原酸含量进行了测定[1]，其他药效成分未予控制，难以全面反映药品质量。口炎清处方中的君药为山银花，是抗菌消炎的主要药味，天冬、麦冬、玄参、甘草辅佐可增强山银花抗炎活性等药效[2-4]。山银花主要含有挥发油、黄酮、有机酸和三萜类成分[2]，有文献报道采用HPLC-UV、HPLC-ELSD法等对山银花中的有效成分进行检测[5-6]，却鲜见对不同厂家口炎清产品中多种有效成分开展的对比研究。灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙是山银花药材的特有成分，金银花药材中几乎不含灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，2015年版《中国药典》一部收载的山银花药材标准的质量分数测定项下是以绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙作为指标成分进行质量控制[7]，[1]30-31。本文拟采用高效液相色谱(HPLC)法测定口炎清产品山银花中的绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的质量分数，对比分析不同厂家口炎清产品的质量差异，探讨产生质量差异的原因，为提升其质量控制水平提供研究基础。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；BT214D电子分析天平(瑞士沙多利斯Sartorius公司)；CP225D电子分析天平(瑞士沙多利斯Sartorius公司)；SB25-12DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

绿原酸对照品(批号为110753-201314，质量分数以96.6%计)，灰毡毛忍冬皂苷乙对照品(批号为111814-201303，质量分数以92.8%计)和川续断皂苷乙对照品(批号为111813-201202，质量分数以93.4%计)均购自中国食品药品检定研究院。9批口炎清产品分别来自于广东、陕西、四川、浙江4个省的4个厂家，批号分别为L4A007、F4A010、K4A002、A5A010、A5A001、A5A002、140904、20130804、14111301，分别简写为A1、A2、A3(颗粒剂)，B1、B2、B3(颗粒剂)，C1(颗粒剂)，D1(胶囊剂)，E1(片剂)。

乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridgeTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.4%(体积分数，下同)醋酸(B)梯度洗脱，洗脱程序：0～10 min，8%A→15%A；10～12 min，15%A→29%A；12～18 min，29%A→33%A；18～25 min，33%A→40%A；流速：1 mL/min，绿原酸采用二极管阵列检测器(PDAD)，检测波长：330 nm，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙采用ELSD检测，检测条件：蒸发温度60 ℃，漂移管温度65 ℃，N2气体积流量1.6 L/min，柱温30 ℃。进样量：8 μL。分别精密吸取混合对照品、供试品(批号：L4A007)、缺山银花阴性对照溶液8 μL注入高效液相色谱仪，分别按上述条件测定，见图1。

mAu6004002000110008006004002000mAu32A1A20510152025B1B2C1C24003002001000600400200010152025t/min05400300200100012001000800600400200010152025t/min05t/min231

1.绿原酸； 2.灰毡毛忍冬皂苷乙； 3.川续断皂苷乙。

A.混合对照品溶液(1为DAD检测，2为ELSD检测，下同)； B.供试品溶液； C.缺山银花的阴性对照溶液。

图1 口炎清测定的HPLC图
Figure 1 HPLC chromatograms of determinations of Kouyanqing products

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸对照品4.37 mg、灰毡毛忍冬皂苷乙对照品6.49 mg置①号25 mL容量瓶中，用少量50%(体积分数，下同)甲醇溶解得对照品溶液1；另精密称取川续断皂苷乙对照品9.18 mg，置②号25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液2。精密吸取5 mL对照品溶液2，置①号25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即制成每1 mL含绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙分别为174.8、259.6、73.44 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取口炎清产品适量，研细，取约5.0 g(样品A)，或约1.5 g(样品B～E)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率37 Hz)30 min，放冷。再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 缺山银花的阴性对照溶液 取天冬、麦冬、玄参、甘草4味药材,按2015年版《中国药典》一部“口炎清颗粒”项下的制法制成阴性对照颗粒。取阴性对照颗粒适量，研细，取约5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按“2.2.2”项下方法操作，即得。

2.3 线性关系的考察

分别精密吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、20 μL进样，按“2.1”项下条件分别测定绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的峰面积，其中绿原酸以峰面积(Y)对绿原酸对照品的进样量(X)进行线性回归，而灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙则分别以峰面积(Y)的ln对数对相应的对照品进样量(X)的ln对数进行线性回归，得3种成分的线性方程见表1。2.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液8 μL，按“2.1”项下色谱条件连续测定6次，测得绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙峰面积的RSD值分别为1.57%、1.47%、2.19%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

取同一批(批号：A1)口炎清产品约5.0 g，共6份，精密称定。分别按“2.2.2”项下方法制得6份供试品溶液，分别进样8 μL，按“2.1”项下色谱条件测定并计算3种成分的质量分数。结果绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙质量分数的RSD值分别为1.86%、1.28%、2.26%，表明本方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

取同一批口炎清产品(批号：A1)供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h进样8 μL，分别按“2.1”项下色谱条件测得其绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙峰面积的RSD值分别为0.83%、1.25%、1.94%(n=8)，表明样品溶液在制备后24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

称取已知质量分数的口炎清产品(A1)约2.5 g，共6份，精密称定。分别精密加入绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品溶液(三者质量浓度分别为3.35、5.83、0.78 mg/mL)各1 mL。分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取8 μL，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的平均回收率分别为100.7%、101.0%、99.6%；RSD分别为1.59%、1.03%、1.34%(n=6)。见表2。

2.8 样品的测定

颗粒剂A1～A3一次服用量是2袋，每袋10 g；颗粒剂B1～B3一次服用量是2袋，每袋3 g；颗粒剂C1一次服用量是2袋，每袋10 g；胶囊剂D1一次服用量是4粒，每粒0.5 g；片剂E1一次服用量是6片，每片0.36 g。分别取4个不同厂家生产的10 批口炎清适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件测定各成分质量分数，结果见表3。

表1 绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的线性方程Table 1 The linear regression equations of chlorogenic aicd,macranthoidin B and dipsacoside B (n=6)

表2 口炎清中3种成分的加样回收率试验结果Table 2 Recovery results of 3 components in Kouyanqing products(n=6)

表3 不同厂家口炎清产品中3种成分的质量分数

由表3可知，不同厂家生产的口炎清产品质量差异很明显，颗粒剂(A1、A2、A3、B1、B2、B3)的质量相比胶囊剂(D1)和片剂(E1)更好。D1样品中不但灰毡毛忍冬皂苷乙质量分数非常低，而且检测不到川续断皂苷乙；E1样品中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的质量分数却异常高。

3 讨论

口炎清产品主要含有有机酸、皂苷和黄酮等有效成分，而2015年版《中国药典》一部中口炎清颗粒质量控制的目标成分只有绿原酸，这为产品的质量埋下很大隐患。本文采用高效液相色谱-紫外与蒸发光散射检测器联用的方法同时测定口炎清产品中的绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的质量分数，方法准确稳定[8-10]。灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的最大紫外吸收是末端吸收，当采用紫外检测器检测时，这2种皂苷的质量分数误差较大；而绿原酸在330 nm有最大吸收，所以分别采用PDAD、ELSD检测绿原酸、皂苷的质量分数，使目标成分的检测误差最小化[11-14]。由于ELSD中的蒸发温度(流动相在漂移管中蒸发的温度)、雾化温度和N2的载气流速直接影响皂苷的质量分数[15-16]，所以本文通过实验比较确定这3个参数的设置，最后选择蒸发温度为65 ℃,雾化温度为60 ℃,N2流速为1.6 L/min。

本试验收集的口炎清产品包括有颗粒剂、片剂和胶囊剂，以绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的质量分数为指标进行比较，发现不同口炎清产品中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙质量分数的差异较大，有效成分的差异化必然会影响用药疗效[17]。

绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙都来源于山银花药材，而口炎清的组方配伍经过多年的临床验证和科学证明，并非是山银花药材的投入量越大，口炎清的药效就越好。某种成分的质量分数高低无法表征中药药效，发挥中药药效的应该是有效成分之间的协同作用。当处方中的各药材都在最佳的配比范围时，药效的协同作用才能最优化。郑艳芳等[4]采用均匀设计方法构建口炎清颗粒具有不同药材投料比例的差异样品，通过药效学研究获得差异样品的抗感染活性数据，运用灰色关联分析方法研究口炎清颗粒差异样品药材质量分数与药效间的关联性，结果发现口炎清颗粒原配方比例的样品药效作用最强。王慧玉[18]在文中指出颗粒剂较胶囊剂和片剂吸收更快，只有药物被吸收之后才能发挥药效，故药物吸收的效果直接关系到药效。

笔者认为不同厂家生产的口炎清产品中有效成分质量分数差异较大的原因：一是不同厂家采购的中药材原料因采收季节、产地、土壤、气候等因素而导致质量差异较大；二是不同剂型的口炎清产品制剂工艺的区别、不同的生产设备型号和设备使用年限的差异也会直接影响制剂中有效成分的质量分数。因此，只有严格把控中药材原料质量，采用合理的生产工艺、淘汰陈旧的生产设备，实现生产在线质量控制，建立完善的现代化生产流水线，才是保证口炎清产品良好质量的关键。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 王志萍，邓家刚，王勤，等.山银花研究的最新进展[J].广西中医学院学报，2008，11(4):59-61.

[3] 王芳，高松.金银花、山银花药理学研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2013，15(4):237-239.

[4] 郑艳芳，李楚源，刘宏，等.口炎清颗粒发挥抗炎药效的组方配伍规律研究[J].中山大学学报(自然科学版)，2016，3(55):145-150.

[5] 谷筱玉，陈振鹏，陈乾平.HPLC-UV-ELSD 测定山银花中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量[J].药物分析杂志，2011，31(5):884-887.

[6] 卢凤来，蒋海英，陈月圆. HPLC-ELSD法测定山银花中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙[J].中成药，2013，35(8):1821-1823.

[7] 李红霞，王雪芹，李振国，等.不同产地金银花与山银花主要成分的含量比较[J].中国药房，2011，22(31): 2935-2937.

[8] 张璐，曾文雪.HPLC-ELSD 法同时测定山银花中绿原酸、木犀草苷和川续断皂苷乙的含量[J].江西中医学院学报，2011，23(4):40-42.

[9] 赵留存，叶世芸，杨春，等.UPLC-ELSD与UPLC-PDA测定山银花中绿原酸的含量对比[J].中国民族民间医药，2015，21(1):21-23.

[10] 赵留存，叶世芸，杨春，等.UPLC-PDA-ELSD测定贵州山银花中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量[J].中国实验方剂学杂志，2015，21(7): 64-67.

[11] 栗时颖，郑兴，廖端芳.山银花研究进展[J].南华大学学报，2009，37(6):744-746.

[12] 柴兴云，王林，宋越，等.山银花中黄酮类成分的研究[J].中国药科大学学报，2004，35(4):299-302.

[13] 柴兴云，李萍，窦静，等.山银花中皂苷类成分的研究[J].中国天然药物，2004，2(2):83-86.

[14] 张璐，曾文雪.HPLC-ELSD 法同时测定山银花中绿原酸、木犀草苷和川续断皂苷乙的含量[J].江西中医学院学报，2011，23(4):40-42.

[15] LI Huijun，LI Ping，YE Wencai.Determination of five major iridoid glucosides inFlosLoniceraeby high-performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection[J]. J Chromatogr A，2003，1008(2):167.

[16] 冯埃生，邹汉法，汪海林.影响高效液相色谱挥发激光散射检测器性能基本因素的考察[J].药物分析杂志，1996，16(6)：414.

[17] 刘祖德，汪杰，赵奎君.不同厂家双黄连口服液的质量考察[J].中国药房，2010，21(28)：2674-2675.

[18] 王慧玉.从剂型角度谈合理使用中成药[J].中国药房，2010，21(43)：4127-4128.

(责任编辑：刘晓涵)

Determinations of chlorogenic aicd,macranthoidin B and dipsacoside B in Kouyanqing products from different manufactures

YAO Xiaohua，KUANG Yanhui，ZHANG Yifan，ZHANG Xiaoyan

(HutchisonWhampoaGuangzhouBaiyunshanChineseMedicineCo.,Ltd.,Guangzhou510515,China)

Objective To improve the drug standard and provide a theoretical basis for the quality evaluation of Kouyanqing products from different manufactures. Methods The contents of chlorogenic acid,macranthoidin B and dipsacoside B in 10 batches of Kouyanqing products from 4 manufactures were determined by HPLC. The determination was performed on Waters XBridgeTM-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)with column temperature set at 30 ℃ and the flow rate was 1 mL/min. The mobile phase was composed of acetonitrile and 0.4% acetum (gradient elution). The chlorogenic acid was detected by diode array detector (PDAD),and the UV detection wavelength was 330 nm. The atomization chamber temperature was set at 60 ℃ and the drift tube temperature of ELSD was set at 65 ℃,with the nitrogen flow rate of 1.6 L/min for macranthoidin B and dipsacoside B. The injection volume was 8 μL. Results Significant difference was observed in contents of chlorogenic aicd,macranthoidin B and dipsacoside in Kouyanqing products from different manufactures. Conclusion The quality of the Kouyanqing products varied greatly among different manufactures,which may result from different raw materials and preparation process.

Kouyanqing; HPLC; chlorogenic aicd; macranthoidin B; dipsacoside B

2016-06-13

姚小华(1983—)，女，硕士，工程师，主要从事中药质量标准研究，电话：020-66282450，Email：yaoxiaohua@813zy.com。

时间：2016-09-30 15:05

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1505.008.html

R284.1

A

1006-8783(2016)05-0596-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016061301