杂交狼尾草和桂牧1号杂交象草的核型分析

罗宗志，林洁荣，2＊，罗虹建，林志魁，陈碧成

（1.福建农林大学动物科学学院，福建福州350000；2.国家菌草工程技术研究中心，福建福州350000；3.福建农林大学食品科学学院，福建福州350000；4.福建农林大学生命科学学院，福建福州350000）

杂交狼尾草和桂牧1号杂交象草的核型分析

罗宗志1，林洁荣1，2＊，罗虹建2，3，林志魁4，陈碧成1

（1.福建农林大学动物科学学院，福建福州350000；2.国家菌草工程技术研究中心，福建福州350000；3.福建农林大学食品科学学院，福建福州350000；4.福建农林大学生命科学学院，福建福州350000）

为狼尾草属种质资源的多样性保护、利用及遗传育种研究提供理论依据，采用常规压片法对杂交狼尾草和桂牧1号杂交象草的染色体数目及核型进行分析。结果表明：2种牧草的染色体基数为x＝7，均为3倍体，染色体数目为2n＝21条。杂交狼尾草的核型公式2n＝3x＝21＝18m（6SAT）＋3sm，染色体相对长度组成I.R.L＝6S＋3M1＋6M2＋6L，第1组和第5组染色体含有随体；桂牧1号杂交象草核型公式2n＝3x＝21＝3m＋18sm，染色体相对长组成I.R.L＝6S＋6M1＋3M2＋6L，未发现随体。杂交狼尾草和桂牧1号杂交象草核型不对称系数分别为60.79%和65.06%，分别属于1B型和2B型，桂牧1号杂交象草的进化程度高于杂交狼尾草。

杂交狼尾草；桂牧1号杂交象草；牧草；染色体；核型

杂交狼尾草（P.americanum×P.purpureum）隶属禾本科狼尾草属，为多年生草本植物，由美洲狼尾草和象草杂交而成，杂种优势明显，具有产量高、抗逆性强、耐刈割和适口性好等优点，近年来作为优质牧草被广泛种植［1-2］。桂牧1号杂交象草〔（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu No.1〕隶属禾本科狼尾草属，为多年生牧草新品种，由矮象草和杂交狼尾草杂交而成，具有生物产量高、营养丰富、抗逆性强和适应性广等优点，近年来在畜牧生产中得到广泛应用［3-4］。到目前为止，国内外科研工作者对杂交狼尾草的研究主要集中在外植体愈伤组织的诱导、碱预处理、栽培技术、青贮饲料和RAPD分析等方面［5-8］，对桂牧1号杂交象草的研究主要集中在栽培技术、植物特征分析和饲喂动物等方面［9-10］，但对细胞核型方面的研究鲜见报道。

染色体是基因的携带者，遗传物质的载体［11］。研究染色体数目与核型对植物系统演化、物种之间亲缘关系及遗传工程中染色体鉴别具有重要意义［12］。目前，狼尾草属一些牧草核型方面的研究已有报道，如朱丹丹等［13］研究了象草和巨菌草的核型及亲缘关系；周自玮等［14］对云南德宏地区的逸生狼尾草进行了分类学鉴定；张伦等［15］对长序狼尾草的核型进行了分析研究。但目前未见关于杂交狼尾草和桂牧1号杂交象草的核型参数信息。为此，笔者以杂交狼尾草和桂牧1号杂交象草为试验材料，采用常规压片法对其染色体数目及核型进行分析，以期为狼尾草属种质资源的多样性保护、利用及遗传育种研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

杂交狼尾草来源于江苏农科院土壤肥料研究所；桂牧1号杂交象草来源于广西畜牧研究所。2种牧草均采集于福建省福州市福建农林大学国家菌草工程技术研究中心种质资源圃（26°10′55.62″N、119°23′21.24″E，海拔10m）。选取不同植株且长势良好，生长100d以上的杂交狼尾草和桂牧1号杂交象草茎秆，按2节切成一段，插入带有细沙的塑料桶中，水以淹没幼芽1cm为宜，将塑料桶摆放在塑料大棚内，每天换水1次，常温下培养生根。待根尖长至2～3cm时，于8：00～9：00截取不同茎秆上生长旺盛、洁白幼嫩的根尖1cm作为试验材料。

1.2 染色体制片

1）预处理。将根尖放入冰水混合物离体处理，然后置于0.05%秋水仙素溶液中室温处理2h。2）固定。用蒸馏水冲洗后将根尖放入4℃卡诺氏液（V无水乙醇∶V冰乙酸＝3∶1）中固定24h。3）解离。将根尖洗净后放入60℃恒温水浴锅中酸解10min，用蒸馏水冲洗酸液10min后转入2%纤维素酶水溶液中室温下酶解1h。4）再固定。将根尖洗净后重新用卡诺氏液固定30min。5）染色。用蒸馏水冲洗酸液后转入卡宝品红染液室温下染色1～2h。6）制片。取根尖置于载玻片上，用镊子和剪刀切取根尖1mm，加1滴45%乙酸溶液，用镊子将根尖充分压碎，并使其均匀分散，加盖玻片，用带有橡皮擦的铅笔轻轻敲打，并用食指压紧，用滤纸吸取多余的乙酸溶液。

1.3 染色体观察

将根尖细胞装片置于尼康NI-U荧光显微镜载物台上，在100倍低倍镜下找到染色体视野后用1000倍油镜继续观察，选择分散良好、轮廓清晰、数目较全的染色体中期相进行拍照。

1.4 核型分析

根据首届全国植物染色体学术研讨会约定的标准［16］，每个品种选择30个以上分裂中期细胞，以85%以上细胞具有相同的染色体数作为该品种的染色体数目，并选择5个图像清晰且分散良好的中期分裂相进行核型分析。首先利用核型分析软件Karyo 3.1处理染色体图片，然后进行染色体编号、确定着丝粒位置并测量其长臂、短臂值。根据所得数据进行同源染色体配对组合并绘制核型图，采用Excel 2010绘制核型模式图，按臂长由长到短的顺序进行编号，最后取5个细胞的平均值作为核型参数。核型分析按照文献［17］的方法，染色体相对长度组成参照文献［18］的分类标准，染色体排序参照文献［19］的命名系统，核型分类参照文献［20］的分类标准，核型不对称性系数参照文献［21］的方法计算。

2 结果与分析

2.1 2种狼尾草属牧草的染色体数目

2.1.1 杂交狼尾草 经观察计数，分散良好、轮廓清晰的杂交狼尾草细胞染色体数目为20条、21条、22条的分别有2个、27个和1个细胞，分别占计数总数的6.67%、90.00%和3.33%。染色体数目为2n＝21条，染色体基数x＝7（图1），为3倍体。

2.1.2 桂牧1号杂交象草 经观察计数，分散良好、轮廓清晰的桂牧1号杂交象草细胞染色体数目为20条、21条、22条的分别有1个、27个和2个细胞，分别占计数总数的3.33%、90.00%和6.67%。染色体数目为2n＝21条，染色体基数x＝7（图2），为3倍体。

图1 杂交狼尾草染色体的中期相（左）和核型（右）Fig.1 Metaphase chromosomes（left）and karyotype（right）ofP.americanum×P.Purpureum

图2 桂牧1号杂交象草染色体的中期相（左）和核型（右）Fig.2 Metaphase chromosomes（left）and karyotype（right）of（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu 1

2.2 2种狼尾草属牧草染色体的核型

2.2.1 杂交狼尾草 从表1、表2可知，杂交狼尾草染色体核型公式为2n＝3x＝21＝18m（6SAT）＋3sm，由此看出，体细胞中期染色体由18条中部染色体和3条近中部染色体组成，其中第1组和第5组染色体含有随体（图3）。从染色体相对长度组成I.R.L＝6S＋3M1＋6M2＋6L看，杂交狼尾草由短染色体、中短染色体、中长染色体和长染色体组成，7组染色体相对长度介于5.95%～23.80%，相对长度指数介于0.42～1.67，最长染色体与最短染色体长度比为4.00，臂比范围在1.43～1.80，无臂比值大于2的染色体。核型不对称系数As.K＝60.79%，按照核型分类标准，杂交狼尾草核型属于1B型。

表1 2种狼尾草属牧草的染色体核型参数Table 1 Karyotype parameters of two Pennisetum varieties

表2 2种狼尾草属牧草的染色体核型特征Table 2 Karyotype characteristics of two Pennisetum varieties

图3 杂交狼尾草（左）、桂牧1号杂交象草（右）染色体的核型模式Fig.3 The karyotype ideogram ofP.americanum×P.purpureum（left）and（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu 1（right）

2.2.2 桂牧1号杂交象草 从表1、表2可知，桂牧1号杂交象草染色体的核型公式为2n＝3x＝21＝3m＋18sm，由此看出，体细胞中期染色体由3条中部染色体和18条近中部染色体组成，未发现随体（图3）。从染色体相对长度组成I.R.L＝6S＋6M1＋3M2＋6L看，桂牧1号杂交象草由短染色体、中短染色体、中长染色体和长染色体组成，7组染色体相对长度介于7.29%～23.24%，相对长度指数介于0.51～1.63，最长染色体与最短染色体长度比为3.19，臂比介于1.68～2.14，臂比值大于2的染色体比例为28.57%。核型不对称系数As.K＝65.06%，按照核型分类标准，桂牧1号杂交象草核型属于2B型。

3 结论与讨论

染色体数目是最稳定的细胞学特征之一，染色体核型可以揭示生物在系统演化中的位置，也是判断生物与其相近物种间亲缘关系的重要依据［22］。研究结果表明，杂交狼尾草、桂牧1号杂交象草染色体数为21条，比例均超过85%，确定其染色体数为2n＝21条。根尖细胞中偶尔存在附加1～2条额外的染色体，也有部分缺失的染色体，可能跟染色体变异有关。陈志彤等［23］研究表明，狼尾草属植物染色体基数分为两大类：一类基数为x＝7，如美洲狼尾草2n＝2x＝14，象草2n＝4x＝28，逸生狼尾草2n＝4x＝28等；另一类基数为x＝9，如中亚白草2n＝4x＝36，东非狼尾草2n＝4x＝36，中序狼尾草2n＝4x＝36等。由此推断，杂交狼尾草和桂牧1号杂交象草染色体基数均归为第一类，即染色体基数x＝7，为3倍体，染色体数目为2n＝21条，杂交狼尾草的染色体数和倍性均与陈礼伟等［24］的研究结果一致，桂牧1号杂交象草的染色体数和倍性均为首次报道。杂交狼尾草与桂牧1号杂交象草染色体数目和倍性均相同，说明其亲缘关系较近，同时也印证其来源相似，都是通过杂交选育而成，杂交狼尾草由4倍体象草和2倍体美洲狼尾草杂交选育而成，桂牧1号杂交象草由矮象草和3倍体杂交狼尾草杂交选育而成。

杂交狼尾草的核型不对称系数为60.79%，由18条中部染色体（m）和3条近中部染色体（sm）组成，核型类型属于1B型；桂牧1号杂交象草的核型不对称系数为65.06%，由3条中部染色体（m）和18条近中部染色体（sm）组成，核型类型属于2B型。根据核型分类标准［25］，核型对称性与物种进化相辅相成，核型对称性越低的生物染色体变异越大，物种进化程度越高；核型对称性越高的生物染色体变异越小，进化程度越低。因此，不论从核型不对称系数还是核型类型看，杂交狼尾草和桂牧1号杂交象草在进化上都属于比较原始的类型，与张怀山［26］对中型狼尾草的研究结果一致；但桂牧1号杂交象草的进化程度比杂交狼尾草高，由于桂牧1号杂交象草由杂交狼尾草和矮象草杂交选育而成，这与杂交可以加速物种进化程度的规律相符［27］。杂交狼尾草第1组和第5组染色体的短臂上均发现了随体，此结果鲜有报道。

目前，从国外引进的狼尾草属牧草较多，命名比较混乱，常出现同物异名、同名异物的现象，给育种工作带来了较大困难，严重阻碍狼尾草属牧草的应用推广和可持续发展。核型分析为研究生物系统发育关系和物种分化提供了重要依据［28］，同时应结合形态学、蛋白质组学和分子生物学等研究方法，为鉴定狼尾草属牧草种质资源、遗传育种、系统演化等提供可靠的理论依据。

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（责任编辑：冯 卫）

Karyotype Analysis ofPennisetumamericanum×Pennisetumpurpureumand（Pennisetumamericanum×Pennisetumpurpureum）×Pennisetumpurpureumschum.cv.Guimu 1

LUO Zongzhi1，LIN Jierong1，2＊，LUO Hongjian2，3，LIN Zhikui4，CHEN Bicheng1
（1.CollegeofAnimalScience，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou，Fujian350000；2.China NationalEngineeringResearchCenterofJUNCAOTechnology，Fuzhou，Fujian350000；3.CollegeofFood Science，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou，Fujian350000；4.CollegeofLifeScience，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou，Fujian350000，China）

The chromosome number and karyotype ofP.americanum×P.purpureumand（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu 1was analyzed by the root tip squash method to provide the theoretical basis for diversity protection，utilization and genetic breeding ofPennisetumgermplasm resources.Results：The basic chromosome number，ploidy and chromosome number ofP.americanum×P.purpureumand（P.americanum×P.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1both are 7，triploid and 21respectively.The karyotype formulas and relative chromosome length ofP.americanum×P.purpureumare 2n＝3x＝21＝18m（6SAT）＋3sm and 6S＋3M1＋6M2＋6Lseparately and there is a trabant on the chromosome of Group 1and Group 5.The karyotype formulas and relative chromosome length of（P.americanumP.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1are 2n＝3x＝21＝3m＋18sm and 6S＋6M1＋3M2＋6Lrespectively and there is no a trabant on their chromosomes.The karyotype asymmetrical coefficient and karyotype ofP.americanum×P.purpureumand（P.americanumP.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1is 60.79%and 1B type，and 65.06%and 2Btype separately.The evolution degree of（P.americanumP.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1is higher thanP.americanum×P.purpureum

Pennisetumamericanum×Pennisetumpurpureum；（Pennisetumamericanum×Pennisetumpurpureum）×Pennisetumpurpureumschum.cv.Guimu 1；forage grass；chromosome；karyotype

S334

A

2016-05-13；2016-07-22修回

国家林业局公益性行业专项“浑善达克沙地疏林型植被建设技术研究”（201504412）；福建省科技重大专项“菌草食药用菌产业化关键技术研究与示范”（2014NZ002-1）；国家菌草工程技术研究中心项目“菌草生物学特性及优良品种评价体系研究”（JCGG14020）

罗宗志（1989-），男，在读硕士，研究方向：草业科学。E-mail：1183525491＠qq.com

＊通讯作者：林洁荣（1958-），男，副研究员，硕士生导师，从事草业科学研究。E-mail：fafumcs＠163.com

1001-3601（2016）09-0370-0008-05