MicroRNA-124抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖及分子机制研究

郑华峰　陶晶　张斌　王纯　吴淳

作者单位：518036北京大学深圳医院心内科



·基础研究·

MicroRNA-124抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖及分子机制研究

郑华峰陶晶张斌王纯吴淳

作者单位：518036北京大学深圳医院心内科

【摘要】目的探讨MicroRNA-124(miR-124)对大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用及可能的调控机制。方法选择10只11周龄雄性SPF级自发性高血压大鼠(SHR)作为实验组及同龄的10只SPF级Wistar大鼠(WKY)为对照组。采用组织贴片法原代培养SHR和WKY主动脉平滑肌细胞。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测miR-124在两组主动脉平滑肌细胞间的表达差异。将miR-124 模拟物或模拟物阴性对照转染SHR主动脉平滑肌细胞，分析过表达miR-124对血管平滑肌细胞增殖的影响。通过数据库及生物信息学软件预测miR-124的靶基因，并利用双荧光素酶报告基因系统进行验证。通过qRT-PCR和Western blot检测靶基因Meox2 mRNA及蛋白表达变化。采用RNA干扰技术，观察敲低Meox2表达对血管平滑肌细胞增殖的影响。结果MiR-124在SHR主动脉平滑肌细胞中的表达为WKY主动脉平滑肌细胞的0.22倍(P<0.01)。体外过表达miR-124可明显抑制SHR主动脉平滑肌细胞的增殖。经生物信息学分析及体外双荧光素酶报告基因系统检测，证实Meox2是miR-124的靶基因。过表达miR-124后SHR主动脉平滑肌细胞中Meox2 mRNA的表达为阴性对照组的0.29倍(P<0.01)；Western blot结果显示，Meox2蛋白表达水平亦明显降低。干扰Meox2的表达亦可降低SHR主动脉平滑肌细胞的增殖。结论MiR-124在SHR中表达下调，其可能通过介导Meox2调控主动脉平滑肌细胞的增殖进而抑制高血压病变的发生过程。

【关键词】miR-124；大鼠，近交SHR；主动脉；肌细胞，平滑肌；增殖；Meox2

MicroRNAs(miRNAs)是一类内生性的小分子RNA，导致靶基因mRNA降解和蛋白翻译抑制[1]。近年来越来越多的研究显示，miRNAs在血管重构形成过程中或在调节平滑肌细胞功能方面也发挥着重要作用。

本研究从已发表的原发性高血压miRNAs表达谱芯片挑选出差异表达的miR-124作为研究对象[2-3]。利用原代培养的自发性高血压大鼠(SHR)和Wistar大鼠(WKY)主动脉平滑肌细胞差异表达的miR-124进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证和比较，揭示miR-124对SHR主动脉平滑肌细胞增殖能力的影响，初步探索高血压所致血管重构的分子生物学机制。

1材料与方法

1.1试剂和仪器

总RNA提取试剂Trizol(Invitrogen，USA)、反转录试剂盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Takara，Japan)，SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR Kit(Takara，Japan)，PCR扩增引物由上海生工公司合成，miR-124模拟物(5′-UAAAUGUCCAUACAA UUAAGGC-3′)及Meox2 siRNA(5′-CAGAUGACU GUGGCAGUGUUGCUUA-3′)均购自苏州吉玛公司，鼠Meox2(ab117551)单克隆抗体购自英国Abcam公司。双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。细胞培养DMEM培养基及胎牛血清购自美国Invitrogen公司。普通PCR仪(BIO-RAD，USA)，NanoDrop 2000c紫外分光光度计(Thermo Scientific，USA)，LightCycler 480荧光定量PCR仪(Roche，Germany)等。

1.2大鼠模型的制备

选择10只11周龄雄性SPF级SHR作为实验组，平均体重(352±27)g。年龄、性别及体重相匹配的10只SPF级WKY大鼠为对照组。所有大鼠均由中山大学动物中心提供。饲养环境为清洁级，温度维持在20℃～22℃。动物分笼饲养，每笼2只，饲以标准饲料，自由饮水，每周换塾料、消毒笼具2次。动物使用符合北京大学深圳医院动物管理委员会管理条例。所有大鼠均适应性饲养1周后，实验组大鼠予以0.45%的氯化钠溶液饲养3周，对照组大鼠正常饮用纯净水。所有大鼠均于饲养4周后处死。

1.3组织贴片法培养原代SHR和WKY主动脉平滑肌细胞

处死喂养4周后造模成功的大鼠，无菌条件下分离全段胸主动脉血管。用眼科镊夹取血管外层组织，DMEM培养基冲洗2遍，用眼科剪剪开血管。之后用棉签把内皮刮掉，DMEM清洗2遍，剪碎血管使之成为1 mm×1 mm大小组织块，放入50 cm2培养瓶培养，并静置于37℃、5%CO2培养箱。培养5～7 d后可见细胞从周围游出，当细胞密度达到80%～90%给予传代，并取对数期生长的细胞进行后续实验。

1.4细胞转染

取培养好的3～6代对数期生长的SHR主动脉平滑肌细胞用于细胞实验。体外实验均分为2组，其中实验组转染miR-124模拟物或siMeox2，阴性对照组转染模拟物阴性对照或阴性对照。按照lipo2000转染试剂说明转染miR-124 模拟物或模拟物阴性对照和siMeox2或阴性对照，之后按照相应实验需要孵育后收集细胞进行实验。

1.5RNA提取及qRT-PCR

按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA。采用NanoDrop 2000c紫外分光光度计对RNA浓度进行测定。根据TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒说明书，反转录合成cDNA。进而按照SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR Kit试剂盒说明书，以合成的cDNA作为模版在LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR反应。MicroRNA PCR反应体系为：模版cDNA 1 μl，miR-124特异性引物0.4 μl，10×miScript Universal Primer 2 μl，2×SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR 10 μl，miR-124上游引物为5′-CTCCGTGTT CACAGCGGACCTT-3′，下游引物为Takara公司试剂盒提供的通用引物；以U6作为内参，U6上游引物为5′-CTCAGAGCGTGGTTCTCCGTCAC-3′，下游引物为5′-TATAAATCTTTACCCTGTTGGCAGT-3′，加RNase-free water至反应总体积为20 μl。PCR反应条件为：95℃ 15 min，随后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45个循环。以实验所用内参U6作为标准化对照，采用ΔΔCT分析方法计算qPCR仪所得数据[4]。

普通基因PCR反应体系为：模版cDNA 1 μl，ABCA1上游引物0.8 μl，ABCA1下游引物0.8 μl，2×SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR 10 μl，Meox2上游引物为5′-TCCAGCCTCCCTCTGTTATCGC-3′，下游引物为5′-CTTTGTTTGGCACTTGGGTTTT-3′；以Gapdh为内参，Gapdh上游引物为5′-CACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物为5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，加RNase-free water至反应总体积为20 μl。PCR反应条件为：95℃ 2 min，随后95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，共45个循环。以实验所用内参GAPDH作为标准化对照，采用ΔΔCT分析方法计算qPCR仪所得数据[4]。

1.6细胞生长实验

将培养好的SHR主动脉平滑肌细胞使用96孔板进行铺板，每孔细胞数达104，之后进行转染miR-124模拟物或模拟物阴性对照和siMeox2或阴性对照。所培养细胞每孔连续4 d每天加入16 μl MTT(5 g/L,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)与细胞共孵育4 h弃去上清，最后以150 μl二甲亚砜溶解，测450 nm波长时的吸光度，各组求均值做生长曲线。

1.7MiR-124靶基因生物信息学预测

采用TargetScan(http://www.targetscan.org/)，miRanda(http://www.targetscan.org/)和PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)等生物信息学数据库预测miR-124的靶基因。

1.8双荧光素酶实验验证靶基因

SHR主动脉平滑肌细胞培养后，按一定细胞数进行铺板，当细胞密度达到50%～80%时，进行细胞转染，共同转染psiCHECK2-Meox2-3′-UTR-WT(野生型)，psiCHECK2-Meox2-3′-UTR-MUT(突变型)和miR-124 mimic到SHR主动脉平滑肌细胞。转染6 h后换液，24 h后裂解细胞，按照Dual-Luciferase®Reporter Assay System(Promega)试剂盒说明进行实验，分别检测萤火虫及海肾的荧光值，验证靶基因是否正确。

1.9Western blot检测蛋白表达水平

将提取好的蛋白使用BCA定量试剂盒定量到3 μg/μl，按比例加入5×SDS上样缓冲液，100℃加热10 min，制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量15 μl，常规电泳、转膜、封闭，加入抗Meox2抗体(ab117551，1∶500稀释)，4℃过夜孵育及相应的二抗(1∶10 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL发光液处理后暗室内曝光胶片，于室温下自然风干，扫描仪扫描结果保存。

1.10统计学方法

2结果

2.1MiR-124在SHR和WKY主动脉平滑肌细胞的表达

通过2-ΔΔCT方法计算SHR和WKY主动脉平滑肌细胞中miR-124的表达量。结果发现miR-124在SHR主动脉平滑肌细胞中的表达为WKY主动脉平滑肌细胞的0.22倍(P<0.01)。

2.2MiR-124对SHR主动脉平滑肌细胞增殖的影响

SHR主动脉平滑肌细胞增殖曲线(图1)。MiR-124模拟物转染组其细胞增殖速度相对阴性对照组明显下降，miR-124模拟物转染组细胞转染后0、1、2和3 d细胞生长抑制率[1-(miR-124模拟物/模拟物阴性对照)×100%]分别为0%、5.24%、8.06%和12.34%，以转染后3 d最高；miR-124 模拟物与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3MiR-124靶基因生物信息学预测结果

利用TargetScan，miRanda和PicTar数据库分析miR-124的靶标基因，结果均发现Meox2为miR-124的靶标基因之一；进一步结合相关参考文献，推测Meox2是miR-124的靶基因。MiR-124与Meox2 3′-UTR结合区域预测，见图2。

图1　MiR-124对SHR主动脉平滑肌细胞增殖的影响

图2　MiR-124 与 Meox2 3′-UTR结合区域预测

2.4靶基因Meox2荧光素酶实验

按照 lipofectamine2000说明书，miR-124 模拟物和模拟物阴性对照分别与psiCHECK2-Meox2-3′-UTR-WT和psiCHECK2-Meox2-3′-UTR-MUT转染SHR主动脉平滑肌细胞。24 h后利用Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行荧光测定。结果见图3。

miR-124可以与Meox2 mRNA的3′-UTR结合，当结合部位突变后，上述结合能力消失图3　靶基因Meox2荧光素酶实验

2.5MiR-124对靶基因Meox2 mRNA及蛋白水平的调控

按上述方法转染miR-124 模拟物后，经荧光定量PCR扩增得到各目的基因的Ct值，以2-ΔΔCT相对定量的方法分析各基因与Gapdh拷贝数的比值，比较实验组和对照组之间的差异。MiR-124转染48 h后，过表达miR-124后SHR主动脉平滑肌细胞中Meox2 mRNA的表达为阴性对照组的0.29倍(P<0.01)；Western blot结果显示，转染48 h后，Meox2蛋白表达水平亦明显降低(图4)。

转染48 h后，Meox2蛋白表达水平亦明显降低图4　MiR-124对靶基因Meox2 mRNA及蛋白水平的调控

2.6Meox2对SHR主动脉平滑肌细胞增殖的影响

SHR主动脉平滑肌细胞增殖曲线见图5。

siMeox2转染组其细胞增殖速度相对阴性对照组明显下降，siMeox2转染组细胞转染后0、24、48、72 h细胞生长抑制率分别为0%、6.18%、10.21%和16.54%，以转染后3 d最高；siMeox2与negative control组比较差异有统计学意义图5　Meox2对SHR主动脉平滑肌细胞增殖的影响

3讨论

研究表明，miRNAs参与了高血压病变中血管重构及平滑肌细胞增殖。体外实验显示，miR-21、miR-24、miR-26a、miR-221/222以及miR-146等均可直接促进血管平滑肌细胞增殖，并调控血小板衍生生长因子(PDGF)及骨形成蛋白(BMPs)等促增殖因子的表达[5-8]。相反，另一些miRNAs，如miR-1、miR-143及miR-145等具有抑制血管平滑肌细胞增殖的作用[9-10]。动物模型研究显示，miR-21、miR-146a和miR-221/222在肾小球球囊损伤的血管组织中表达升高，且过表达上述miRNAs可明显缓解血管损伤的程度[5,8,11]。另有研究显示，糖尿病大鼠体内的血管平滑肌miR-125b表达升高，而miR-218缺失可导致视网膜血管生成障碍[12-13]。

本研究从已发表的原发性高血压miRNAs表达谱芯片挑选出差异表达的miR-124作为研究对象[2-3]。首先通过qRT-PCR验证miR-124确实低表达于SHR主动脉平滑肌细胞。针对miR-124的既往研究，虽然证明其参与内皮细胞功能及心肌发育，但是它是否参与平滑肌细胞增殖尚不清楚。进而通过体外MTT实验，首次证明了miR-124具有直接抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。实验发现，过表达miR-124可显著抑制SHR主动脉血管平滑肌细胞的增殖能力。

MicroRNA对靶标基因的作用机制主要通过其5′的种子序列识别并结合靶标基因3′-UTR，从而抑制靶标基因表达。绝大多数microRNA以不完全配对的方式结合靶标基因引发不同程度的靶标基因翻译受抑。少数microRNA以完全配对的方式结合靶标基因，不仅导致靶标基因翻译起始/延伸抑制，而且还促进其mRNA降解[14]。我们获取了Meox2 mRNA的3′-UTR序列，通过生物信息学分析发现人Meox2 3′-UTR存在miR-124的保守结合位点。上述结果提示miR-124以完全配对的方式结合Meox2 3′-UTR，同时暗示miR-124对靶标基因Meox2的表达具有较为重要的调控效应。

Meox2作为一种血管平滑肌细胞的调节因子，在多种心血管疾病中表达下调，如球囊损伤血管、肺动脉高压、Alzheimer病的脑血管等，过表达Meox2可减轻上述血管损伤的程度[15-17]。通过生物信息学预测及结合相关参考文献，推测Meox2可能是miR-124引起的SHR主动脉血管平滑肌细胞增殖的靶基因。我们构建了psiCHECK2-Meox2-3′-UTR-WT和psiCHECK2-Meox2-3′-UTR-MUT与miR-124 模拟物共转染到SHR主动脉血管平滑肌细胞，探讨miR-124对人SHR主动脉血管平滑肌细胞Meox2 3′-UTR的靶向结合作用。结果显示，转染miR-124模拟物对psiCHECK2-Meox2-3′-UTR-WT荧光素酶活性有明显抑制作用，而对psiCHECK2-Meox2-3′-UTR-MUT荧光素酶活性无影响。同时qRT-PCR和Western blot分析发现过表达miR-124可明显降低靶基因Meox2 mRNA及蛋白表达水平。最后体外细胞实验发现，干扰Meox2的表达亦可降低SHR主动脉平滑肌细胞的增殖，上述结果与过表达miR-124基本一致。

综上所述，MiR-124在SHR中表达下调，其可能通过介导Meox2调控主动脉平滑肌细胞的增殖进而参与高血压血管病变的发生过程。

参考文献

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(本文编辑：周白瑜)

Inhibition effect of microRNA-124 on rat vascular smooth muscle cell proliferation and its molecular mechanismZhengHuafeng,TaoJing,ZhangBin,WangChun,WuChun

DepartmentofCardiology,PekingUniversityShenzhenHospital,Shenzhen518036,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the inhibition effect and molecular mechanism of microRNA-124 (miR-124) on rat vascular smooth muscle cell proliferation. MethodsWe applied 10 male 11-week-old spontaneously hypertensive rats (SHR) as experimental group and 10 age matched Wistar Kyoto (WKY) rats as control group. Aortic smooth muscle cells were isolated from the medial layer of thoracic aorta of SHR and WKY rats and cultured in Dulbecco′s modified eagles medium (DMEM). Quantitative real-time PCR (RT-PCR) was used to detect the expression of miR-124 in SHR and WKY aortic smooth muscle cells. The SHR aortic smooth muscle cells were transfected with either miR-124 mimics or NC mimics control. MTT assay was used to explore the proliferation of SHR aortic smooth muscle cells in vitro. The targeted gene of miR-124 was predicted by bioinformatics, and verified by dual luciferase reporter assay. The over-expression of miR-124 in SHR aortic smooth muscle cells was analyzed by the mRNA RT-PCR and protein expression of Meox2 by Western blot analyses. Finally, SHR aortic smooth muscle cells proliferation was also detected using MTT assay after treated with siMeox2. ResultsThe expression of miR-124 in SHR aortic smooth muscle cells was 0.22 times of WKY aortic smooth muscle cells (P<0.01). Over-expression of miR-124 could significantly inhibit SHR aortic smooth muscle cells proliferation. Bioinformatics analysis and dual luciferase reporter assay demonstrated that Meox2 was a target gene of miR-124. The mRNA level of Meox2 in SHR aortic smooth muscle cells after treated with miR-124 mimics was 0.29 times of transfected NC mimics control (P<0.01). Western blot showed that Meox2 protein was also decreased after treated with miR-124 mimics. Knock-down Meox2 could also arrest the SHR aortic smooth muscle cells proliferation. ConclusionsThe expression of miR-124 is down-regulated in SHR, which may be mediated by Meox2 regulation of SHR aortic smooth muscle cells proliferation and inhibit the occurrence of hypertensive disease.

【Key words】miR-124；Rats, inbred SHR；Aorta；Myocytes, smooth muscle；Proliferation；Meox2

(收稿日期:2015-08-15)

Corresponding author:Wu Chun, Email: wuchun2012@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2016.01.013

通讯作者：吴淳，电子信箱：wuchun2012@163.com