AKT和HK2在口腔鳞状细胞癌中的表达①

李善昌，吴　骞，丁元圣，孙　宇，闫　磊

(佳木斯大学附属第二医院口腔颌面外科,黑龙江 佳木斯 154002)



AKT和HK2在口腔鳞状细胞癌中的表达①

李善昌，吴骞，丁元圣，孙宇，闫磊

(佳木斯大学附属第二医院口腔颌面外科,黑龙江 佳木斯 154002)

摘要：目的： 探讨AKT、HK2在口腔鳞癌及其癌旁组织中的表达情况，并对其表达水平与临床特征之间的关系进行相关性分析，探讨其与口腔鳞癌发生、发展和转移的关系。方法：应用病例对比设计，采用免疫组化SP法对50例口腔鳞癌石蜡标本及20例癌旁正常组织中AKT、HK2蛋白的表达情况进行研究，使用SPSS21.0统计学软件对实验数据进行统计学处理，进而分析其与临床病理特征的关系。结果： AKT,HK2在病例组中表达明显高于对照组。AKT与HK2表达与细胞分化、临床分期、淋巴结转移及局部侵袭性相关，差异结果具有统计意义(P<0.05)。结论：AKT,HK2在口腔鳞癌中的表达上调，AKT与HK2蛋白表达呈正相关。

关键词：口腔鳞癌；AKT；HK2；免疫组化

口腔鳞癌是颌面部最常见的恶性肿瘤。肿瘤标志物检测对肿瘤细胞的早期诊断，淋巴结的转移及预后生存分析有独特作用[1,2]。在绝大多数恶性肿瘤细胞中，即使在氧气充足的条件下，糖酵解代谢也异常活跃，对肿瘤细胞的增殖提供能量，称为Warburg效应，目前这一效应已经成为了许多恶性肿瘤的显著特征[3]。糖酵解过程中的关键因子葡萄糖转运体(glucose transporter,GLUT)、己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、乳酸脱氢酶(lactate dehygrogenase,LDH)等在许多癌细胞中呈高表达，其中HK在口腔癌中的研究还比较少。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-AKT 即蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB)通路，也就是PI3K-AKT通路，参与了糖酵解酶HK的上游调控，所以HK2与AKT在糖酵解过程中扮演重要角色，二者与肿瘤关系密切。

1材料和方法

1.1材料

选取在佳木斯大学附属第二医院口腔医院收治的口腔鳞癌患者50例，其中男34例，女16例，年龄≤60岁22例，年龄>60岁28例。所有患者均有完整的临床病理资料且术前均未经过放化疗。采用TNM 分类标准进行临床分期，其中Ⅰ~Ⅱ期31例、Ⅲ~Ⅳ期19例；病理分级，分为高分化30例，中~低分化20例；经病理检查证实有颈部淋巴结转移的29例，未转移的21例；另外选择20例癌旁正常组织作为对照组。癌旁组织取自距癌组织>1cm处。所有病理标本经HE染色后由两位高年资病理科医生复诊，均证实为口腔鳞状细胞癌。

1.2实验试剂

小鼠抗人HK2多克隆抗体，兔抗人AKT多克隆抗体，试剂盒(SP-9000)，DAB 试剂盒。

1.3免疫组化检测

全部组织样本均行常规固定, 包埋, 连续切片, 抗原修复, SP法染色。选择用试剂公司提供的已知高表达阳性切片在同一条件下作为阳性参照, 选择PBS替代一抗作为阴性参照。免疫组化染色步骤按试剂盒的说明进行染色。

1.4结果判定

AKT,HK2阳性表达为棕黄色或棕色团块。采用双盲法读片,随机在显微镜下选取5个100视野，每个视野下细胞数不少于100个,计数肿瘤细胞中阳性个数百分率：阳性细胞数<10%记为(-)；阳性细胞数在10%及以上的均记为(+)。

1.5统计学方法

采用 SPSS21.0统计软件分析所有实验数据均，蛋白阳性表达情况与其它临床病理参数的相关性采用χ2检验分析，AKT与HK2两种蛋白之间表达的关系应用Spearman等级相关分析检测，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1AKT在口腔鳞癌组织及癌旁组织中的表达

AKT在肿瘤细胞中阳性染色主要定位在胞浆，为棕黄色或棕色团块。在口腔鳞癌组中阳性表达率为72%,见图1。在正常口腔黏膜组中阳性表达率为40%。两组间结果不同，有意义 (P<0.05)，见表1。

图1　AKT在口腔鳞癌中的表达(×200)

2.2AKT的表达与临床病理的关系

高分化者阳性率为55%(11/20)，中、低分化者阳性率约为83.3%(25/30)，(P<0.05)。TNM分期中，I-II期阳性表达率约为61.2%(19/31)，III-IV期阳性表达率为89.4%(17/19), (P<0.05)。有淋巴结转移组阳性表达率约为82.7%(24/29)，无淋巴结转移组阳性表达率约为57.1%(12/21), (P<0.05),有局部侵袭性组阳性表达率约为83.3%(25/30),无局部侵袭性组阳性表达率约为55%(11/20)，(P<0.05)，见表2。

2.3HK2在口腔鳞癌组织及癌旁组织中的表达

HK2在肿瘤细胞中阳性染色主要定位在胞浆，为棕黄色或棕色团块。在口腔鳞癌组中阳性表达率为66%，见图1。在正常口腔黏膜组中阳性表达率为35%。两组间结果不同，有意义(P<0.05),见表1。

2.4HK2的表达与临床病理的关系

高分化者阳性率为45%(9/20)，中、低分化者阳性率约为80%(24/30)，(P<0.05)。TNM分期中，I-II期阳性表达率约为54.8%(17/31)，III-IV期阳性表达率为84.2%(16/19), (P<0.05)。有淋巴结转移组阳性表达率约为82.7%(24/29)，无淋巴结转移组阳性表达率约为42.8%(9/21), (P<0.05) 有局部侵袭性组阳性表达率约为80%(24/30),无局部侵袭性组阳性表达率约为45%(9/20)，(P<0.05)，见表2。

2.5口腔鳞癌组织中AKT蛋白与HK2蛋白的相关性

统计本实验数据，AKT蛋白与HK2蛋白在50例口腔鳞癌组织中同时表达阳性28例，同时表达阴性9例，经 Spearman 秩相关性分析，二者呈正相关关系(P=0.004,r=0.399),见表3。

表2　AKT和HK2表达与口腔鳞癌临床病理的关系

图2　HK2在口腔鳞癌中的表达(×200)

HK2AKT+-rP+2850.399<0.05-89

3讨论

AKT蛋白是一种丝/苏氨酸激酶,是细胞内病毒原癌蛋白一的同族体[4]，它在PI3K-AKT信号转导通路中处于核心地位, 参与细胞的周期性调节、生长代谢、增殖、凋亡等多种生物学活性，此蛋白的异常表达是造成肿瘤细胞发生、发展的关键[5]。哺乳动物基因组包括3种 AKT 基因，编码 AKT1(PKBα)、 AKT2(PKBβ) 、AKT3(PKBγ) 异构体，同源性达80%以上[6]。其中，糖酵解代谢过程中的关键酶HK就是AKT控制的下游分子之一，两者在促进细胞分裂增殖和抑制凋亡中起到关键作用。有相关文献报道AKT还可以维持HK的高活性，提示说明两者可能在癌症发展过程中有协同作用，这与本实验中AKT与HK2在50例口腔鳞癌中的表达情况经Spearman相关性分析认为二者呈显著性正相关的研究结果相一致。并且AKT的阳性表达率与组织学类型、细胞分化程度、临床分期,局部侵袭性及淋巴结转移有关。

HK2在许多生长迅速的恶性肿瘤细胞中均呈现高表达[7]，例如乳腺癌、肺癌、宫颈癌[8~10]等。HK家族分四个亚型，分别是HK1,HK2,HK3,HK4,但只有HK2对葡萄糖最具亲和力并且其催化能力最强。它是糖酵解化学反应过程中第一个最关键的重要酶，将所有进入细胞内的葡萄糖完全催化反应成为6-磷酸葡萄糖，在通过糖酵解途径产生大量能量和中间代谢产物以满足肿瘤细胞分裂增殖的需求。同时有研究表明,AKT可以促进HK2与线粒体的结合，肿瘤细胞内的HK2黏附在线粒体外膜(OMM)上,并与线粒体外膜通道蛋白VDAC1发生结合,从而发挥其抑制凋亡效应。其次，本实验结果发现口腔鳞癌无淋巴结转移组中HK2蛋白阳性率显著低于淋巴结转移组，且HK2的阳性表达随着病理分级的降低、临床分期的增高而明显增强，提示HK2蛋白表达上调在口腔鳞癌的发生、发展、浸润及转移过程中可能起一定作用，这与许多国内外学者的研究相似。

综上所述， AKT和HK2蛋白均可能成为检测口腔鳞癌的重要指标，并且为恶性肿瘤的靶向治疗提供一种可能。

参考文献：

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[2]李峰，满大鹏，南晓利，等.CD147和MMP-2在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义[J].黑龙江医药科学，2011,34(4):25-26

[3]Koppenol WH, Bounds PL, Dang CV. Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism[J]. Nat Rev Cancer, 2011, 11(5): 325-337

[4]Chang F,Syrjanen S,Shen Q,et al.Human papilloma virus involvement in esophageal precancerous lesions and squamous cell carcinomas as evidenced by microscopy and different DNA techniques[J].Scand J Gastroenterol,1992，27(7):553-563

[5]Mahajan K, Mahajan NP. PI3K-independent AKT activation in cancers: a treasure trove for novel therapeutics[J]. J Cell Physiol, 2012, 227(9): 3178-3184

[6]Gao G F,Roth M J,Wei W Q,et al.No association between HPV infection and the neoplastic progression of esophageal squamous cell carcinoma:result from across- sectional study in a high-risk region of China [J].Int J Cancer, 2006, 119(6): 1354-1359

[7]Wolf A, Agnihotri S, Micallef J, et al. Hexokinase 2 is a key mediator of aerobic glycolysis and promotes tumor growth in human glioblastoma multiforme[J]. Exp Med, 2011, 208(2): 313-326

[8]Katie KB. Comparison of glycolytic enzyme and isoenzyme activity in breastcancers and dysplasia[J]. Med Pregl, 2012,65(5-6) :200-205

[9]Mamede M, Higashi T,Kitaichi M,et al.FDG uptake and PCNA, Glut-1,andHexokinase-II expressions in cancers and inflammatory lesions of the lung[J].Neoplasia, 2005,7(4):369-379

[10]Tong SY,Lee JM,Ki KD,et al. Correlation between FDG uptake by PET/CT andthe expressions of glucose transporter type 1 and hexokinase II in cervical cancer[J]. Gynecol Cancer, 2012,22(4):654-658

The expression and significance of AKT and HK2 proteins in oral squamous cell carcinoma

LIShan-chang,WUQian，DINGYuan-sheng，SUNYu，YANLei

(The Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154002，China)

Abstract:Objective: To examine the expression and clinical and pathological significance of PTEN and PI3K in oral squamous cell carcinoma(OSCC). Methods: The Expression levels of PTEN, PI3K protein were determined by using immunohistochemistry SP in 52 cases of OSCC and 20 specimens of normal oral mucosa tissues. The correlation between PTEN and PI3K protein and between the two markers and clinical and pathological parameters were analyzed. Results: AKT, HK2 expression was significantly higher in the patient group. AKT and HK2 expression was related with cell differentiation, clinical stage, lymph node metastasis and local invasiveness. The difference was statistically significant. Conclusion:AKT, HK2 expression in oral squamous cell carcinoma. AKT was positively correlated with protein expression of HK2.

Key words:oral squamous cell carcinoma;AKT;HK2

(收稿日期：2015-09-18)

中图分类号：R739.85

文献标识码:A

文章编号：1008-0104(2016)01-0019-03

作者简介:李善昌(1969～)男，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师，教授，硕士研究生导师。通讯作者:吴骞(1991～)男，辽宁沈阳人，在读硕士研究生。E-mail:1755372155@qq.com。

基金项目：黑龙江省教育厅科研项目，编号：12521553。