MCM与核心组蛋白基因的负相关表达模式的初步探讨

张依德 王远亮

（重庆大学生物工程学院 重庆 400044）

MCM与核心组蛋白基因的负相关表达模式的初步探讨

张依德 王远亮

（重庆大学生物工程学院 重庆 400044）

本研究采用了荧光定量PCR技术，用稳定表达的管家基因为内参基因，分析MCM及核心组蛋白家族基因负相关模式的动态表达情况，以探索它们之间的关系，以期为基因的负相关表达模式提供支持。结果显示：两组基因在细胞周期中不论何时上调或下调，只要一组基因出现上调，另一组基因总是出现下调的情况，也就是说两组基因的表达模式总是相反的。Clb-Cdk1激酶在MCM基因和核心组蛋白基因的转录过程中扮演着极其重要的角色，它可以调控两组基因的表达，是导致两组基因呈负相关模式关键点。

酿酒酵母 负相关模式 细胞周期 荧光定量PCR

对于基因调控网络的构建都是在识别相似表达基因或正相关表达基因的相互作用，而当前的研究发现，一个或多个基因表达的表达上调或者下调同时会导致其上游或下游一个或多个基因表达的改变，据此提出“负相关模式”这一概念。本课题组就此模式提出NCFCA算法，并将其应用于研究酿酒酵母细胞周期的基因表达谱，发现微小染色体维持蛋白基因与核心组蛋白基因可能符合负相关模式概念。

对两组基因进行GO功能富集分析，结果显示它们都具有多种相似功能，主要体现在共同参与DNA构象变化、蛋白质-DNA复合物的组装、细胞成分的组装和合成等。因此我们对这两组基因在酵母细胞周期中的表达情况进行具体探讨与研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

实验室野生型BY4743，W303A。

1.1.2 主要试剂及仪器

蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，琼脂粉；SYBR、RNA提取及反转录试剂盒；α因子；PCR仪、凝胶成像、PCR电泳仪系统；台式高速冷冻离心机。

1.1.3 引物设计及合成

根据NCBI数据库公布的酿酒酵母的目标基因序列设计引物。1.2试验方法

1.2.1 酿酒酵母细胞周期同步化

酵母细胞W303、BY4741于YPD培养基25℃水浴锅中培养8-10个小时，然后再置于25℃有氧培养箱中培养过夜。加入α因子到培养基中，使其浓度为600ng/ml。在25℃有氧培养箱中孵育2小时候，水洗，重新加入到新鲜培养基中以有利于细胞重新进入有丝分裂。通过计数发芽细胞量及检测芽的大小来评估酵母细胞同步化水平。

1.2.2 Total RNA的提取

酵母细胞经同步化处理后每10min取样一次，共取样130min（约二个细胞周期）。使用试剂盒提取酵母总RNA，跑琼脂糖凝胶电泳，检测所提取R NA的完整性。

1.2.3 全RNA反转录

使用试剂盒进行反转录。因每隔10分钟取样一次，RNA易降解，故采用两步法进行反转录。所得基因组c D N A作为实时荧光定量PCR的检测样品。

将反转录得到的cDNA保存在—4℃冰箱中，可长期保存。

1.2.4 荧光实时定量RT-PCR

以反转录所得cDNA为模板，ACT1、ALG9为内参基因，实时定量PCR实验检测两个家族共14个基因在三个细胞周期内的表达情况。

2 实验结果

2.1 细胞周期同步化处理

经α因子处理2h后，水洗加入新鲜培养基培养，每10分钟取样一次，显微镜下观察计数酵母细胞发芽率及细胞核大小。统计结果显示细胞基本处于细胞周期内同一阶段，完成同步化处理，可进行后续实时定量PCR等实验。

2.2 荧光实时定量PCR

选择使用酵母菌ACT1及ALG9为内参基因，实时定量PCR检测14个基因的表达变化情况。据内参基因表达量对比得出：随着细胞周期的进行，MCM家族6个基因表达呈现出在酵母细胞周期内呈现出周期性的表达趋势，从M期后期和G前1期开始，6个基因的表达水平逐渐上调直至最高表达水平，然后开始逐渐下调，到M期表达水平最低，然后随着G1前期开始又重新开始上调；而组蛋白家族8个基因也呈现出周期性表达的趋势，从G1期后期和S期前期开始，8个基因的表达呈下调的趋势，到直到最低表达水平，随后开始逐渐上调，到M期表达接近最高水平。

综合比较两组基因在细胞周期中的表达情况，发现不管上调或下调的时间，只要一组基因出现上调，另一组基因总是出现下调的情况，也就是说两组基因的表达模式总是相反的。这一结果符合“负相关模式”这一概念，也就是说两组基因为负相关模式。

3 讨论

本实验研究中酵母细胞M C M与组蛋白两组基因在D N A复制起始及延伸过程中具有相似的同能，但在多个细胞周期内对两组基因的表达的上调与下调同时改变，并出现相反表达模式。考虑两个基因之间能量守恒情况，当一个基因上调时，它必须要从另外一个基因获取一部分能量，以维持上调，同时使得另外一个基因的表达下调。此外，同一通路中和两个通路之间的基因也会存在负相关性，负相关基因具有一定的功能相似性。由此本课题组提出了两个基因的负相关配对是一个全新的概念。

目前本研究对MCM与组蛋白这一对负相关配对基因形成的原因进行了理论数据及实验分析，得出结果如下：

在M的后期和G1的前期，Clb-Cdk1抑制Yox1和Yhp1的表达，不再去抑制启动子抑制蛋白Mcm1，从而使得MCM基因得以表达；与此同时，Clb-Cdk1则与其他细胞周期蛋白一起作用，招募RSC复合物以及HIR复合物做为抑制物结合到HTA1-HTB1的启动子区，从而抑制组蛋白基因的转录。

在M/G1期之外，Clb-Cdk1不再抑制Yox1和Yhp1的表达，转录因子Mcm1与抑制子Yox1和Yhp1结合形成复合物，这两个复合物再结合到MCM基因的启动子区，进而抑制MCM基因的转录；同时，Clb-Cdk1与其他调控蛋白通过细胞周期信号以及磷酸化作用解除SWI和SNF对HIR复合物的抑制作用，使HIR复合物从共抑制子转变成共激活子，从而激活组蛋白基因的转录。

以上事实表明：Clb-Cdk1在MCM基因和核心组蛋白基因的转录过程中扮演着极其重要的角色，它可以调控两组基因的表达，是导致两组基因呈负相关模式关键点，推测两组基因可能同时参与细胞内同一生物过程，但是由于细胞内能量供求关系的平衡，所以两者之间存在此消彼长的关系，即一组基因上调则另一组基因则下调。

Q75

A

1674-2060（2016）02-0325-01