高效液相色谱法测定狼疮性肾炎患儿血浆中环磷酰胺的含量

鲁卓林 李惠芬 刘力 洪阁 纪海莹

300134天津市儿童医院药剂科（鲁卓林），风湿免疫科（刘力）；300134天津市儿童医院儿科研究所（李惠芬）；300192天津，中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津市生物医学材料重点实验室（洪阁、纪海莹）

高效液相色谱法测定狼疮性肾炎患儿血浆中环磷酰胺的含量

鲁卓林 李惠芬 刘力 洪阁 纪海莹

300134天津市儿童医院药剂科（鲁卓林），风湿免疫科（刘力）；300134天津市儿童医院儿科研究所（李惠芬）；300192天津，中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津市生物医学材料重点实验室（洪阁、纪海莹）

目的 建立测定狼疮性肾炎（LN）患儿血浆中环磷酰胺含量的高效液相色谱（HPLC）方法，为制订个体化治疗方案提供依据。方法 色谱柱为Hypersil ODS-2 C18柱，流动相为乙腈-水（体积比为30∶70），流速为1.0 ml/min，柱温为30℃，检测波长为195 nm，进样量为20 μl。以异环磷酰胺为内标，血浆样品经甲醇沉淀蛋白、离心取上清液进样检测。结果 血浆中环磷酰胺的质量浓度在0.5～20.0 mg/L范围内，环磷酰胺与内标的峰面积比呈良好的线性（r=0.999 4），最低检出限为0.1 mg/L；日内、日间精密度和稳定性实验的相对标准偏差（RSD）均＜8%；加样回收率为100.60%～101.05%，结果满意。结论 该法简便、快速、准确、重现性好，可用于LN患儿血浆中环磷酰胺的含量测定及免疫抑制治疗的临床药学监护。

高效液相色谱法； 血药浓度； 环磷酰胺； 狼疮性肾炎

Fund program：Science and Technology Fund of Tianjin Municipal Health Bureau(2014KZ032)

0 引 言

狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是一种儿童期常见的继发性肾小球疾病，临床表现为肾病综合症、急性肾炎综合症、慢性肾炎综合症及孤立性蛋白尿等[1]。从发病年龄看，主要集中于学龄期儿童，学龄前儿童及幼儿比例较少；从性别比例看，女性患儿的发病率明显高于男性[2-3]。LN是儿童系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）最严重的并发症，直接影响着SLE患儿的生存质量及临床预后[4]。目前，临床上采用激素联合环磷酰胺的经典治疗方案来控制LN患儿的短期病程及长期预后[5]，但是由于环磷酰胺毒副作用大、安全范围窄，特别是在不同人群和不同疾病状态下，其体内药代动力学行为存在明显差异，为保证患者的用药安全，需要对环磷酰胺的血药浓度进行实时监测。

近年来，国内外有关高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定血浆中环磷酰胺含量的研究相对较少。De Miranda Silva等[6]和Silvertand等[7]采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）法分别对乳腺癌和恶性血液病患者血浆中环磷酰胺的药代动力学进行了研究，虽然此方法灵敏度高、专属性强，但由于测试仪器操作复杂、价格昂贵，直接导致检测成本较高。王来成等[8]和黎远冬等[9]采用HPLC法分别对23例小儿难治性肾病综合征（refractory nephrotic syndrome，RNS）和2例肿瘤患者血浆中环磷酰胺的血药浓度进行了测定，虽然检测方法简便、准确、重现性好，但在流速和分析时间设定方面仍存在一些值得探讨的问题。

本研究建立了HPLC测定LN患儿血浆中环磷酰胺含量的方法。该法简单、快速、准确，可用于治疗窗窄、个体化差异大的儿童血药浓度检测和药代动力学研究标准化操作规程的建立，为减少化疗药物的不合理使用和制订个体化给药方案提供技术支持。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2014年5月至2015年8月天津市儿童医院收治的LN（Ⅳ型）患儿9例，年龄为5～14岁，平均年龄为（9.2±2.8）岁，平均体质量为（29.5±2.8）kg。

1.2 主要材料与仪器

环磷酰胺对照品（批号为100234-201303）、异环磷酰胺对照品（批号为100595-201302）（中国食品药品检定研究院），醋酸泼尼松片（批号为1408069）（天津力生制药股份有限公司），注射用环磷酰胺（批号为14082125）（江苏恒瑞医药股份有限公司），乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。空白血浆采自健康儿童，由天津市儿童医院血库提供。

Dionex UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），ME55电子天平（瑞士Mettler Toledo国际有限公司），Mili-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

液相色谱柱为Thermo Fisher HypersilTMODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（体积比为30∶70），流速为1.0 ml/min，柱温为30℃，检测波长为195 nm，进样量为20 μl。

1.3.2 溶液的制备

对照品溶液：精密称取环磷酰胺对照品10.0mg，置于50 ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀备用。

内标溶液：精密称取异环磷酰胺对照品10.0mg，置于10 ml容量瓶中，加无水甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀备用。

1.3.3 血浆样品的处理

精密吸取250 μl血浆样品，置于1.5 ml离心管中，精确加入5 μl内标溶液，再加入1 ml甲醇，旋涡混匀30 s，10 000 r/min离心5 min，取上清液20 μl进样测定[10-12]。

1.3.4 系统适用性实验

分别取空白血浆、加药血浆（精密吸取250 μl空白血浆，加入25 μl对照品溶液）和血浆样品（LN患儿按500 mg/m2静脉滴注环磷酰胺，给药后抽取静脉血样，分离血浆），按血浆样品处理方法操作（空白血浆不加内标溶液），取上清液20 μl，按色谱条件进样测定，记录色谱图。

1.3.5 线性范围和检出限的测定

取空白血浆，加入适量对照品溶液，配制环磷酰胺质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的系列血浆样品，按血浆样品处理方法操作，取上清液20 μl，按色谱条件进样测定，记录峰面积。以环磷酰胺的质量浓度（mg/L）为横坐标（x），环磷酰胺与内标（异环磷酰胺）的峰面积比为纵坐标（y），进行线性回归分析。

取上述血浆样品，逐级稀释，按血浆样品处理方法操作。取上清液20 μl，按色谱条件进样测定，记录峰面积，计算环磷酰胺色谱峰峰高与噪声的比值（信噪比），以信噪比为3时血浆样品中所含环磷酰胺的量为检测限。

1.3.6 精密度实验

取空白血浆，加入适量对照品溶液，配制环磷酰胺质量浓度分别为5.0、10.0、20.0 mg/L的血浆样品，每个浓度设5个平行样，按血浆样品处理方法操作，取上清液20 μl，按色谱条件进样测定，记录峰面积。同日内每个质量浓度的血浆样品平行操作5次，同时每天操作1次，连续考察5 d，分别计算日内和日间精密度。

1.3.7 稳定性实验

取空白血浆，加入适量对照品溶液，配制环磷酰胺质量浓度分别为5.0、10.0、20.0 mg/L的血浆样品，每个浓度设5个平行样，按血浆样品处理方法操作，取上清液20 μl，分别于室温放置0、1、2、3、4、5、6 h后，按色谱条件进样测定，记录峰面积，考察血浆样品室温存放期间的稳定性。

1.3.8 回收率实验

取空白血浆，加入适量对照品溶液，配制环磷酰胺质量浓度分别为5.0、10.0、20.0 mg/L的血浆样品，每个浓度设5个平行样，按血浆样品处理方法操作，取上清液20 μl，按色谱条件进样测定，记录峰面积，依据标准曲线计算血浆样品中环磷酰胺的含量，并计算回收率。

1.3.9 LN患儿血浆样本的测定

采用口服激素联合环磷酰胺静脉注射的冲击治疗方案：每例患儿按1 mg/kg给予口服醋酸泼尼松片，同时按500 mg/m2静脉滴注环磷酰胺，于给药1、12、24 h后分别抽取患儿静脉血样，分离血浆，按血浆样品处理方法操作后取上清20 μl，按色谱条件测定环磷酰胺的血药浓度。

2 结果

2.1 系统适用性实验

由图1可知，血浆中的内源性物质对环磷酰胺的检测无干扰。色谱基线平稳，加药血浆和LN患儿血浆按环磷酰胺计理论塔板数均≥5 000，且环磷酰胺主峰与内标及各相关物质均可达到基线分离，分离度均＞1.5。环磷酰胺与内标的保留时间分别为4.66 min和4.28 min。

2.2 线性范围和检出限的测定

测定结果表明，血浆中环磷酰胺的质量浓度在0.5～20.0 mg/L范围内，环磷酰胺与内标的峰面积比线性关系良好，环磷酰胺的回归方程为y=0.0471x-0.006 9（r=0.999 4），血浆中环磷酰胺的最低检出限为0.1 mg/L。

2.3 精密度实验

由表1可知，本研究建立的测定方法精密度较好，平均日内精密度为4.30%，平均日间精密度为4.48%，且日内、日间精密度的RSD均＜8%。

表1 加药血浆中环磷酰胺的精密度（n=5，x±s）

2.4 稳定性实验

稳定性实验结果表明，加药血浆在6 h内稳定性良好，可满足检测需求；不同质量浓度的环磷酰胺峰面积的RSD分别为6.79%、2.12%和3.41%。（表2）

表2 加药血浆中环磷酰胺的稳定性（n=5，x±s）

2.5 回收率实验

向空白血浆中加入适量对照品溶液使环磷酰胺的质量浓度分别为5、10、20 μg/ml，其加样回收率为100.60%～101.05%，结果满意。（表3）

表3 加药血浆中环磷酰胺的添加回收率（n=5，x±s）

图1 空白血浆、加药血浆及狼疮性肾炎患儿血浆的高效液相色谱图

2.6 LN患儿血浆样本的测定

按500 mg/m2静脉滴注环磷酰胺1、12、24 h后，LN患儿血浆中环磷酰胺的血药浓度分别为（12.29± 3.40）、（3.21±1.19）、（0.65±0.71）mg/L。结果表明，本研究建立的测定LN患儿血浆中环磷酰胺含量的方法简便、快速、准确，可用于环磷酰胺的血药浓度监测。（表4）

表4 狼疮性肾炎患儿静脉滴注环磷酰胺后不同时间血药浓度的检测结果

3 讨论与结论

激素联合环磷酰胺静脉冲击疗法是目前LN（Ⅳ型）患儿的一线治疗方案，可有效地控制狼疮活动，明显减轻血尿和蛋白尿，改善肾功能，但也存在疗程长、总剂量大（150 mg/kg）、副反应较多（如肝毒性、骨髓抑制和性腺毒性）等缺陷[13]。在临床应用过程中，为了确保治疗方案的安全、有效和经济，减少免疫抑制剂的滥用和药品不良反应的发生，需要合理掌握环磷酰胺的给药剂量、用药间隔和治疗周期[14]。同时，环磷酰胺是一种典型的前体药物，须在体内经肝药酶代谢活化才能发挥治疗效果。当血药浓度升至一定水平后，环磷酰胺在肝脏的活性代谢会达到饱和，而肝脏灭活的代谢支路会得到加强，产生氯乙醛等毒性代谢产物，此时若继续增大用量将不会提高疗效而只会产生更大的毒性反应[8]。因此，在治疗方案实施过程中需对环磷酰胺进行临床药代动力学监测，以使患儿得到更安全有效地治疗。

据文献报道，环磷酰胺血药浓度的测定方法有气相色谱（gas chromatography,GC）、HPLC和HPLCMS法等。其中，以GC法的灵敏度最高，但由于样品前处理过程中存在衍生化反应副产物较多、提取效率低和部分代谢物不稳定等原因，限制了该法的广泛应用[15]。近年来发展起来的HPLC-MS法同样具有专属性强和检出限低的优点，但也存在分析时间长、测定成本高和操作复杂等缺点[16]。本研究采用配有紫外检测器的HPLC，以甲醇沉淀蛋白后直接测定环磷酰胺的血药浓度，其血浆样品处理步骤简单、快速，色谱分析时间短，回收率高，重复性好，可在有限的时间内完成大批量患儿血浆样本中环磷酰胺的含量测定，适合在治疗药物监测中推广应用。

本研究考察了不同比例的甲醇-水和乙腈-水为流动相时的色谱分离效果，并参考文献[17]以缓冲盐溶液代替水相来改善色谱峰形；经综合比较，最终选择乙腈-水（体积比为30∶70）为流动相，该条件下环磷酰胺与内标物可完全分离，且不受内源性物质及其他杂质干扰。通过将对照品溶液在190～400 nm范围内进行紫外-可见光谱扫描，发现环磷酰胺在195 nm波长附近有最大吸收，故选195 nm作为检测波长。环磷酰胺在LN患儿体内的药代动力学行为存在个体差异，笔者对9例患儿的检测结果显示，给药后1、12和24 h血药浓度的波动范围较大，体现出明显的个体化差异，与国内报道比较接近[8]，符合儿童群体药代动力学研究的特点，提示应收集更多的临床样本深入研究血药浓度与治疗效果之间的关系，为及时调整治疗方案和保证患儿用药安全提供理论依据。

利益冲突 无

[1]Ntali S,B ertsias G,Boumpas DT.Cyclophosphamide and lupus nephritis:when,how,for how long?[J].Clin Rev Allergy Immunol, 2011,40(3):181-191.DOI:10.1007/s12016-009-8196-0.

[2]Perfumo F,Martini A.Lupus nephritis in children[J].Lupus,2005, 14(1):83-88.DOI:10.1191/0961203305lu2065oa.

[3]Soni SS,Gowrishankar S,Adikey GK,et al.Sex-based differences in lupus nephritis:a study of 235 Indian patients[J].J Nephrol,2008, 21(4):570-575.

[4]Hiraki LT,Feldman CH,Liu J,et al.Prevalence,incidence,and demographics of systemic lupus erythematosus and lupus nephritis from 2000 to 2004 among children in the US Medicaid beneficiary population[J].Arthritis Rheum,2012,64(8):2669-2676.DOI: 10.1002/art.34472.

[5]Niaudet P.Treatment of lupus nephritis in children[J].Pediatr Nephrol,2000,14(2):158-166.DOI:10.1007/s004670050034.

[6]De Miranda Silva C,Dumêt Fernandes BJ,Marques Pereira MP,et al.Determination of cyclophosphamide enantiomers in plasma by LC-MS/MS:application to pharmacokinetics in breast cancer and lupus nephritis patients[J].Chirality,2009,21(3):383-389.DOI: 10.1002/chir.20596.

[7]Silvertand LH,VazvaeiF,WeiglP,etal.Simultaneous quantification of fludarabine and cyclophosphamide in human plasma by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2005,19(24):3673-3680.DOI:10.1002/rcm.2242.

[8]王来成,关凤军,王晖,等.HPLC-UV法测定环磷酰胺血药浓度及其临床应用[J].儿科药学杂志,2014,20(7):34-36.Wang LC,Guan FJ,Wang H,et al.Determination of cyclophosphamide in human plasma by HPLC-UV and correlation research between plasma concentration and clinical efficacy[J].J Pediatr Pharm,2014,20(7):34-36.

[9]黎远冬,张炜炜,梁宁生.HPLC法测定人体血浆中异环磷酰胺及环磷酰胺的浓度[J].广西医科大学学报,2014,31(1):102-104. Li YD,Zhang WW,Liang NS.Determination of ifosfamide and cyclophosphamide in human plasma by HPLC[J].J Guangxi Med Univ,2014,31(1):102-104.

[10]Huitema AD,Tibben MM,Kerbusch T,et al.Simple and selective determination of the cyclophosphamide metabolite phosphoramide mustard in human plasma using high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl,2000,745(2): 345-355.DOI:10.1016/S0378-4347(00)00295-4.

[11]Yang L,Feng J,Zhang F,et al.Fast quantification of cyclophosfamide and its N-dechloroethylated metabolite 2-dechloroethylcyclophosphamide in human plasma by UHPLC-MS/MS[J].Biomed Chromatogr,2014,28(10):1303-1305.DOI:10.1002/bmc.3168.

[12]Kalhorn TF,Howald WN,Cole S,et al.Rapid quantitation of cyclophosphamide metabolites in plasma by liquid chromatographymass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2006,835(1/2):105-113.DOI:10.1016/j.jchromb.2006.03.022.

[13]简福梅,梁冬梅,赖小卿.狼疮性肾炎患儿免疫抑制治疗的药学监护[J].中国医院用药评价与分析,2016,16(5):691-693.DOI: 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.05.043. Jian FM,Liang DM,Lai XQ.Pharmaceutical care for children with lupus nephritis in immunosuppressive therapy[J].Eval Anal Drug-Use Hosp Chin,2016,16(5):691-693.DOI:10.14009/j.issn.1672-2124.2016.05.043.

[14]陈玲燕，王雪丁，黄民.环磷酰胺的药物基因组学研究进展[J].药学学报,2014,49(7):971-976. Chen LY,Wang XD,Huang M.Advances in the research of pharmacogenomics of cyclophosphamide[J].Acta Pharm Sin,2014, 49(7):971-976.

[15]Kalhorn TF, Ren S, Howald WN, et al. Analysis of cyclophosphamide and five metabolites from human plasma using liquid chromatography-mass spectrometry and gas chromatographynitrogen-phosphorus detection[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 1999,732(2):287-298.DOI:10.1016/S0378-4347(99)00300-X.

[16]Sannolo N,Miraglia N,Biglietto M,et al.Determination of cyclophosphamide and ifosphamide in urine at trace levels by gas chromatography/tandem mass spectrometry[J].J Mass Spectrom, 1999,34(8):845-849.DOI:10.1002/(SICI)1096-9888(199908)34: 8＜845::AID-JMS839＞3.0.CO;2-Q.

[17]Malothu N,Veldandi UK,Devarakonda RK,et al.Development of rapid and simple HPLC method forthe determination of cyclophospamide in human serum[J].Asian J Pharm Clin Res,2009, 2(3):34-38.

Determination of cyclophosphamide in plasma of children with lupus nephritis by HPLC

Lu Zhuolin,Li Huifen,Liu Li,Hong Ge,Ji Haiying

Department of Pharmacy(Lu ZL),Department of Rheumatology(Liu L),Tianjin Children's Hospital,Tianjin 300134, China;Institute of Pediatrics,Tianjin Children's Hospital,Tianjin 300134,China(Li HF);Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China(Hong G,Ji HY)

Liu Li,Email:may13_cn@126.com

Objective To establish an high performance liquid chromatography(HPLC)method for the determination of cyclophosphamide in plasma of children with lupus nephritis(LN),and to provide basis for the individualized drug therapy.Methods HPLC was performed on the column of Hypersil ODS-2 C18 with the mobile phase of acetonitrile-water(30∶70,V/V)at a flow rate of 1.0 ml/min.The column temperature was 30℃,and the detection wavelength was 195 nm.The injection volume was 20 μl.The plasma samples were deproteinized by methol with ifosfamide as the internal standard,and the centrifugal supernatant was injected for analysis.Results The linear range of plasma cyclophosphamide of children with LN was 0.5-20.0 mg/L(r=0.999 4).The detection limit of cyclophosphamide was 0.1 mg/L.Relative standard deviation(RSD)of stability,the intra-day and inter-day precisions were all less than 8%.The recovery rate was 100.60%-101.05%,and the result was satisfactory.Conclusions The method is simple,rapid,accurate,convenient and with good reproducibility.It can be used for the determination of plasma cyclophosphamide concentration of children with LN and clinical pharmaceutical care of immunosuppressive therapy.

High performance liquid chromatography; Plasma concentration; Cyclophosphamide; Lupus nephritis

刘力，Email:may13_cn@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2016.05.008

天津市卫生局科技基金（2014KZ032）

2016-07-12）