糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经II相代谢酶GCLc和GST pi蛋白与mRNA的影响

张岩　穆晓红　孙文　吴丽丽　郭璇　许光远　李伟笠　姜月滢　邓莉　洪明昭　刘铜华

100078　北京中医药大学东方医院内分泌科[张岩(博士研究生)、郭璇(博士研究生)、许光远(博士研究生)、姜月滢(硕士研究生)、洪明昭(硕士研究生)、刘铜华]；北京中医药大学中医养生所(孙文、吴丽丽、刘铜华)；北京中医药大学研究生院(刘铜华)；北京中医药大学东直门医院骨科[穆晓红、李伟笠(硕士研究生)]；陕西中医药大学内分泌科[邓莉(硕士研究生)]



·论著·

糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经II相代谢酶GCLc和GST pi蛋白与mRNA的影响

张岩穆晓红孙文吴丽丽郭璇许光远李伟笠姜月滢邓莉洪明昭刘铜华

100078北京中医药大学东方医院内分泌科[张岩(博士研究生)、郭璇(博士研究生)、许光远(博士研究生)、姜月滢(硕士研究生)、洪明昭(硕士研究生)、刘铜华]；北京中医药大学中医养生所(孙文、吴丽丽、刘铜华)；北京中医药大学研究生院(刘铜华)；北京中医药大学东直门医院骨科[穆晓红、李伟笠(硕士研究生)]；陕西中医药大学内分泌科[邓莉(硕士研究生)]

【摘要】目的观察糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经II相代谢酶谷氨酸半胱氨酸连接酶亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLc)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione s-transferase，GST) pi蛋白与mRNA的影响，探讨糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经保护作用机制。方法雄性SD大鼠，高脂饲料与小剂量链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)联合诱发糖尿病大鼠模型，模型成功后将糖尿病大鼠随机分为5组：模型组、α-硫辛酸(alpha lipoic acid ，ALA)组(0.0268g/(kg·d)，糖痹康高(2.5g/kg)、中(1.25g/kg)、低(0.625g/kg)剂量组，每组10只，另将雄性SD大鼠10只设为正常组。治疗12周后测大鼠右侧坐骨神经传导速度；Western blot检测大鼠坐骨神经中GCLc和GST pi蛋白的表达；实时荧光定量PCR检测大鼠坐骨神经中GCLc和GST pi mRNA的表达。结果与模型组相比，12周后ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经传导速度明显升高(P<0.05)；ALA组、糖痹康高、中剂量组GCLc和GST pi蛋白及mRNA表达均明显高于模型组(P<0.05)。结论糖痹康可通过诱导Ⅱ相代谢酶GCLc和GST pi改善糖尿病大鼠坐骨神经损伤。

【关键词】糖痹康；糖尿病周围神经病变；坐骨神经；Ⅱ相代谢酶；G谷氨酸半胱氨酸连接酶亚基和谷胱甘肽-s转移酶Pi

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)重要并发症之一，随着DM患病率及病程的延长，DPN发病率呈上升趋势。在对全国住院DM患者并发症及其相关危险因素10年回顾性调查分析显示，中国DPN的发生率达60.3%[1]，而DPN是DM患者并发足部溃疡，最终导致截肢的主要原因[2-3]，早期干预DPN高危患者可有效降低糖尿病足部溃疡发生率和截肢率[4]。而中医药在DPN的防治方面积累了丰富的经验，但其作用机制尚未完全阐明。氧化应激在糖尿病慢性并发症的发生发展过程中处于核心地位[5]，因此氧化/抗氧化失调是DPN发生的重要机制。II相代谢酶(phase II enzymes)又称II相抗氧化酶(phase II antioxidant enzymes)，包括谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione s-transferase，GST)等，能够保护机体免受毒性物质及某些活性物质的侵害，因此诱导其亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLc)和GST pi的表达，能够有效对抗有害物质侵害导致的相关疾病[6]。

前期研究表明，中药复方糖痹康具有抗氧化应激，保护DPN大鼠坐骨神经的作用[7]。本实验在前期研究基础上，观察糖痹康对DPN大鼠II相代谢酶GCLc和GST pi蛋白与mRNA的影响，探讨糖痹康对DPN大鼠坐骨神经保护作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物

SD大鼠，4周龄，雄性，60只，体质量(100±20)g，由北京维通利华动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2004-0009。

1.2药品制备

糖痹康(黄芪15 g、女贞子10 g、桂枝9 g、赤芍9 g、黄芩5 g、黄连3 g、水蛭1 g、鸡血藤15 g、醋制延胡索5 g)由北京中医药大学中药学院提供；α-硫辛酸(alpha-lipoic acid，ALA)，由德国史达德大药厂提供，进口药品注册证：H20110104。

1.3试剂及仪器

高脂饲料，购自北京科奥协力饲料有限公司；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美国，sigma)；罗氏血糖仪(罗氏，ACCU-CHEK)；BL-420S 生物机能换能系统(成都泰盟科技有限公司)；紫外分光光度计eppendorf(德国Biophotometer)；电泳后用半干转电转印仪(美国 Bio-Rad Trans-Blot SD)；PVDF膜上(德国，默克微孔)；一抗：兔来源的单克隆抗体GCLc(美国Abcam公司，货号：ab190685，批号：GR175654-1)，兔来源的单克隆抗体GST pi(美国Abcam公司，货号：ab138491，批号：GR100476-11)；二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2301，批号：109525)；Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)；核酸紫外分光光度计(德国Biophotometer公司)；M-MLV反转录试剂盒(日本Takara公司)；PCR引物(生工生物工程(上海)有限公司)；Oligo(dT)(购自Takara公司，日本)；dNTP(日本Takara公司)；DNA Marker(日本Takara公司)；SYBR mix(瑞士Roche公司)；Real-Time PCR仪(美国ABI公司)

1.4模型建立与分组

雄性SD大鼠60只，适应性喂养1周后，随机选取10只作为正常组，予普通饲料喂养，余鼠给予高脂饲料连续喂养，4周后腹腔注射STZ 35 mg/kg造糖尿病大鼠模型。72小时后用罗氏血糖仪测大鼠尾尖血随机血糖，将两次随机血糖水平>16.7 mmol/L且血糖水平稳定3天者视为造模成功，按体质量和血糖水平随机分为模型组、ALA组、糖痹康高、中、低剂量组，每组各10只，其中ALA 0.0268 g/(kg·d)组腹腔注射，糖痹康高2.5 g/(kg·d)、中1.25 g/(kg·d)、低0.625 g/(kg·d)剂量组灌胃，正常组和模型组给予同体积生理盐水。实验期间明暗各12小时，大鼠自由摄食摄水，连续治疗12周。

1.5血糖检测

分别在第0周和12周末测试大鼠尾尖血，观察随机血糖的变化。

表1　引物序列

1.6神经电生理的测定

应用BL-420S 生物机能换能系统，采用双通道法，分别测定SD大鼠右侧坐骨神经运动神经(motor nerve conduction velocity，MNCV)和感觉神经传导速度(sensory nerve conduction velocity，SNCV)。麻醉后的大鼠置于恒温垫上俯卧位固定，暴露大鼠右侧坐骨神经，将暴露的神经轻轻挂在包含两组刺激电极和记录电极的电极钩上，神经表面滴加37℃预热的石蜡油使神经保持在湿润温暖的环境中。参数设置：细电压，单刺激，延时100 ms，波宽1 ms，刺激强度1 v。测量方法：(1)MNCV：将电极挂钩通道1刺激电极的一端置于神经近端，通道2记录电极的一端置于神经远端，刺激后记录诱发动作电位，施予刺激到出现诱发电位的时间称为潜伏期，刺激电极起始点与记录电极起始点间的长度为距离，本实验采用双通道记录法，故以两通道动作电位出现峰位的时间差为潜伏期值，以两通道刺激电极间距离0.8 cm为刺激电极起始点与记录电极起始点间长度值。代入公式：MNCV=刺激电极起始点与记录电极起始点间的长度(m)/潜伏期(s)。(2)SNCV：交换刺激电极与记录电极的位置，使之与测定MNCV的位置相反。SNCV 的计算方法同MNCV。

1.7Western Blot 测定GCLc、GST pi的蛋白表达

提取大鼠坐骨神经总蛋白，分别以10%和12% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜、封闭，分别加入一抗GCLc(1∶2000)和GST pi(1∶2000)，孵育，4℃过夜。次日加入二抗(1∶10000)，显影、定影。以GADPH为内参。用IPP软件对扫描图象的目的条带进行灰度分析。

1.8real-time PCR测定GCLc和GST pi的mRNA表达

Trizol法提取坐骨神经总RNA，Real-Time PCR 检测GCLc和GST pi的mRNA表达水平。用2-ΔΔCT计算各个样本目的基因的表达变化。

1.9统计学方法

2结果

2.1糖痹康改善SD大鼠随机血糖

与正常组相比较，治疗前、后各组大鼠随机血糖水平均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，治疗后，ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠血糖显著降低(P<0.01或P<0.05)。见表2。

表2　各组大鼠不同时期随机血糖　

注： 与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01

2.2糖痹康改善SD大鼠坐骨神经传导速度

与正常组比较，治疗后，模型组大鼠MNCV和SNCV显著下降(P<0.01)，ALA组，糖痹康高剂量组大鼠MNCV和SNCV无明显下降(P>0.05)；与模型组比较，ALA组，糖痹康高、中剂量组大鼠MNCV和SNCV明显升高(P<0.01或P<0.05)，糖痹康低剂量组无明显变化(P>0.05)。见表3。

表3　各组大鼠坐骨神经传导速度比较　

注： 与正常组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，

dP<0.01

2.3糖痹康对GCLc和GST pi蛋白表达的影响

与正常组相比较，各糖尿病组GCLc蛋白表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经GCLc蛋白表达显著升高(P<0.01或P<0.05)，糖痹康低剂量组大鼠坐骨神经GCLc蛋白表达与模型组比较无显著差异(P>0.05)。见图1，表4。

与正常组比较，各糖尿病组GST pi蛋白表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经GST pi蛋白表达明显升高(P<0.01或P<0.05)，糖痹康低剂量组大鼠坐骨神经GST pi蛋白表达与模型组比较无显著差异(P>0.05)。

A.正常组　B.模型组　C.ALA组

组别GCLcGSTpi正常组1.00±0.001.00±0.00模型组0.26±0.04a0.30±0.09aALA组0.51±0.05ac0.57±0.07ac糖痹康高剂量组0.48±0.08ac0.78±0.10ac糖痹康中剂量组0.37±0.11ab0.47±0.10ab糖痹康低剂量组0.24±0.07a0.40±0.09a

注： 与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01

2.4糖痹康对GCLc和GST pi的mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组、糖痹康中、低剂量组GCLc的mRNA表达显著降低(P<0.01或P<0.05)；与模型组比较，ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经GCLc的mRNA表达显著升高(P<0.01或P<0.05)。低剂量组坐骨神经GCLc的mRNA表达升高不明显(P>0.05)。

与正常组比较，各组GST pi的mRNA表达明显降低(P<0.01)；与模型组比较，ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经GST pi的mRNA表达明显升高(P<0.01或P<0.05)。低剂量组坐骨神经GST pi的mRNA表达升高不明显(P>0.05)。

表5　各组大鼠坐骨神经mRNA表达

注： 与正常组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，

dP<0.01

3讨论

DPN是DM慢性并发症之一，其发病率高，严重威胁着患者的生存质量及寿命，给家庭和社会造成了巨大的经济负担，因其发病机制复杂，是多种因素共同作用的结果，因此其治疗一直成为研究的热点和难点[8]。

中医药治疗DPN有独特优势，其全方位、多靶点的中医药治疗方案临床效果显著[10-12]，但其作用机制尚未完全阐明。糖痹康(已获国家专利：ZL200810167551.1)在《金匮要略·血痹虚劳》黄芪桂枝五物汤的基础上加减化裁，临床疗效显著，前期研究表明[7]，糖痹康能显著升高DPN大鼠血清中消除过氧化物的超氧化物岐化酶和分解过氧化物的谷胱甘肽过氧化物酶水平，从而改善坐骨神经传导速度。

应激蛋白的上调是机体对抗不利条件的一种普遍保护机制，这其中包括氧化应激反应。GCLc和GST pi是II相解毒酶，具有神经保护作用[9-12]。GCLc是GSH的限速酶，是维持细胞内GSH动态平衡的关键因素，而GSH在细胞防御氧化侵害和维护氧化还原动态平衡起重要作用，是保证细胞凋亡功能正常的重要酶[13]。GST催化谷胱甘肽与各种亲电物质结合并促进其排泄，并可以去除机体内过氧

(下转本期第302页)

Effect ofTangbikangon the protein and mRNA of Phase II metabolizing enzymes of GCLc and GST pi of sciatic nerve in diabetic rats

ZHANGYan，MUXiao-hong，SUWen，etal.DepartmentofEndocrinology，DongfangHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China．

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of Tangbikang(TBK) on the protein and mRNA of Phase II metabolizing enzymes of GCLc and GST pi of sciatic nerve in diabetic rats to investigate the protection of the sciatic nerve in rats with diabetic peripheral neuropathy. MethodsMale SD rats were selected for research，high fat diet combined with low dose of streptozotocin(STZ)to induced diabetic model, and the rats were randomly divided into 5 groups：model group，alpha-lipoic acid (ALA) group，TBK high dose group(2.5g/kg)，medium dose group(1.25g/kg)and low dose group(0.625g/kg)，10 rats in each group and another 10 male SD rats were put into normal group. After 12 weeks treatment，the right sciatic nerve conduction velocity was measured by direct method，and the protein and mRNA of GST pi and GCLc were detected by Western blot and real-time PCR. ResultsAfter 12 weeks，the sciatic nerve conduction velocity in the ALA group，TBK high and medium dose groups was significantly higher than that in the model group(P<0.05). The expression of GST pi and GCLc protein and mRNA in the ALA group, TBK high and medium dose groups were significantly higher than those in the model group. ConclusionTBK can improve the sciatic nerve injury of DPN rats by inducing Phase II metabolizing enzymes of GCLc and GST pi of sciatic nerve in diabetic rats.

【Key words】Tang Bi Kang;Diabetic peripheral neuropathy;Sciatic nerve;Phase II drug metabolizing enzymes;GCLc and GST pi

Corresponding author：LIU Tong-hua， E-mail： thliu@vip.163.com

【中图分类号】R587.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.03.007

作者简介：张岩(1985- )，女，2013级在读博士研究生。研究方向：糖尿病及其并发症临床及实验研究。E-mail：lylu111@126.com通讯作者： 刘铜华( 1963- )，博士，博士后，教授，主任医师，博士生导师。研究方向：糖尿病及其并发症临床及实验研究。E-mail：thliu@vip.163.com

基金项目：国家自然科学基金( 81373587)；教育部中医养生学重点实验室，北京市中医养生学重点实验室