肉及肉制品中动物源性成分核酸检测方法研究进展

石盼盼，李旭，吴昊，陈蕾（河南省产品质量监督检验院，河南郑州450000）

肉及肉制品中动物源性成分核酸检测方法研究进展

石盼盼，李旭，吴昊，陈蕾
（河南省产品质量监督检验院，河南郑州450000）

民以食为天，食以安为先。肉类为人类的生命活动提供了丰富的蛋白质、脂肪和B族维生素等，是人们生活的重要食品。但在利益的驱动下肉制品行业内掺假事件时有发生，严重侵害了消费者权益，并造成了不良的经济和社会影响。因此加强研究肉类产品动物源性成分的检测技术，广泛开展肉及肉制品中动物源性成分的检验意义重大。本文综合论述了目前已有的肉及肉制品中动物源性成分的核酸检测技术，并对有应用前景的新技术做了简要介绍。

肉及肉制品；动物源性成分核酸检测技术；聚合酶链式反应

随着人们生活水平的提高，饮食中肉类的比例逐年增加［1］，但肉制品行业内用低价肉伪造高价肉，用非食用肉伪装食用肉的现象时有发生。随着人们安全意识的提高和食品监管体系的完善，市场对肉及肉制品的动物源性成分的检测要求也越来越高。近年来分子生物学技术飞速发展，动物源性成分的各种检测技术相继涌现，能够快速、精准、灵敏地鉴定各类肉及肉制品的真实属性。

核酸因其作为遗传物质的优良特性，可准确鉴定肉及肉制品的物种源性。与依靠肌肉纹理辨别和依靠蛋白质的免疫反应或者电泳技术鉴别相比，此类方法优势明显［2-3］。我们把目前肉及肉制品中动物源性成分的核酸检测方法分为三类：一是以PCR技术为基础的检验方法，通过PCR扩增物种特异性条带结合相应的核酸检测技术来判断动物源性；二是依赖于分子杂交技术的检测方法，通过物种特异性探针与样品核酸分子杂交来鉴定，PCR扩增也是该法的基础；三是以不同于PCR的核酸扩增技术为基础的检测新方法。本文综合论述了目前已有的肉及肉制品中动物源性成分的核酸检测技术，并对有应用前景的新技术做了简要探讨。

1　基于PCR技术的检测方法

1.1PCR电泳法

PCR电泳法检测动物源性成分的原理是样品DNA用物种特异性引物扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成相系统检测，然后通过与阳性条带比对是否有目的条带的扩增，来检测样品的动物源性。该方法检验肉制品动物源性成分最常用是利用线粒体细胞色素氧化酶b亚基（Cyt b）基因核苷酸序列在畜禽各种物间的特异性进行的。我国出入境检验检疫行业标准SN/T2978-2011《动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法》即采用此方法。也有学者以物种的其他特异性基因为检测对象进行研究，康文欣根据鸭特异性细胞色素C氧化酶III基因序列［4］设计引物，用PCR电泳法检测市售肉卷中鸭源性成分，特异性灵敏性良好，能够达到实际检测需求。

PCR电泳法是动物源性成分核酸检测的基础技术，它通常还需要对扩增产物回收经过核酸测序比对或者借助荧光定量检测才能准确判断，检验步骤多，过程比较耗时，已经逐渐或被其他新技术取代。但荧光定量等其他技术检测灵敏度高易造成假阳性，PCR电泳法常在其他检测技术出现假阳性假阴性无法判断时，作为补充验证的作用存在。所以对于复杂的加工肉制品动物性成分检测，实际工作中此法不可缺少。

1.2多重PCR法

多重PCR法是以PCR电泳法为基础，在同一PCR反应体系内加上两对以上的引物，可以针对多个DNA模板，或同一模板的不同区域，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，又称多重引物PCR。

冯海永等建立了羊肉产品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、马和牦牛动物源性成分鉴别的七重PCR检测技术体系［5］。他设计七对特异性引物经PCR扩增后，采用常规的琼脂糖凝胶电泳分离相互差异在41 bp以上的多重PCR扩增产物，实现了对7个物种的快速准确鉴别。

多重PCR成本低效率高。但引物的设计要考虑到不能有互补序列，否则会因交叉反应使有些条带无法扩增；引物的浓度和延伸时间等参数都需要优化，技术要求高。此技术可致力于开发检测试剂盒。

1.3荧光定量PCR法

荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，根据荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后结合软件实现对未知模定性定量分析的实验方法。在肉制品动物源性成分检验中，多用到TaqMan荧光探针检测法［6］。

王颖［7］等以猪线粒体12S rRNA基因序列为靶位点设计引物和探针，进行荧光定量PCR扩增，建立了畜肉食品中猪源性成分检测体系，该方法快速准确特异性强，灵敏度高。

荧光定量PCR检测的巨大优势是实现了对样品DNA的定量检测，并且简化了实验步骤，在一次PCR中就可以完成对目标片段的定性和定量检测，省去凝胶电泳和扫描过程。此法是目前肉制品动物源性成分检测应用的热门技术。但其灵敏性高，容易造成假阳性。对实验条件和检验人员的要求也非常高。

1.4多重实时荧光PCR法

结合多重PCR与荧光定量的优势，在多重PCR体系中加入各种动物源性的荧光探针，根据实时荧光PCR的扩增结果进行检测的技术。

我国出入境检验检疫行业标准［8］中动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分检测就采用三重实时荧光PCR法，可以在一次PCR反应中实现对样品中三种动物源性成分的定性检验。

多重荧光PCR把基于PCR检测的高效优势发挥到极致，可以在一小时左右的时间内实现对多个样品的多种动物源性实现准确的定性分析。但此法会出现某一或者几个基因扩增效率低，会导致定量检测不准确，甚至定性也无法判定的情况。所以条件的优化非常重要。

1.5限制性片段长度多态性PCR法（restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）

PCR-RFLP法是用各物种通用引物进行PCR扩增，扩增产物经同一限制性内切酶酶切后不同物种可产生不同长度的酶切片段，依据酶切结果鉴定样品中相关肉源性成分的方法。

冯海永等设计出羊（绵羊、山羊）和鸭的通用引物，扩增出472 bp的片段，分别使用限制性内切酶Spe I 和Bsu36I对羊和鸭的PCR产物进行酶切，羊（绵羊、山羊）的特异性片段为213 bp和259 bp、鸭的为95 bp 和377 bp［9］。

对于成分复杂的样品PCR-RFLP法易产生大量的酶切片段使结果难以分析，更适合选用PCR-TRFLP（末端限制性片段长度多态性）检测方法。PCR-TRFLP 与PCR-RFLP只分析酶切后末端片段的长度多态性使结果简化，再结合毛细管电泳分析结果更加准确直观。田金辉［10］等通过UP-PCR-TRFLP方法鉴定生鲜肉中的牛羊肉成分，分别设计不同荧光标记的上下游引物，PCR扩增产物经酶切后，在测序仪上用毛细管电泳检测带荧光的末端片段即可鉴定样品中的牛羊肉成分。

此法较单纯的PCR电泳法省时省力，并且简便可靠。但对于多成分样品会出现一定范围内使用的情况，如李通等用此法检测掺杂猪肉的牛羊肉时发现，只有当猪肉掺杂比例大于30%时才有明显的酶切条带，对于一部分混合肉制品并不适用［11］。所以设计合适的通用引物及选择合适的酶切位点对于此法非常重要。

1.6随机扩增多态性PCR法 （Random Amplified Polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）

RAPD-PCR技术是用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链（一般为10个bp）作为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增，最后将扩增出的条带进行胶回收测序比对，来确定该扩增产物的基因类型。

王昱等用随机扩增多态性PCR法，扩增未知肉品DNA，对阳性产物回收、克隆并测序比对后，发现是火狐基因序列，根据数据库火狐序列信息设计特异性引物，荧光定量PCR法再次检测该肉品DNA，结果表明样品中含有火狐肉［12］。

相比与特异性引物探针法只能鉴定已知的肉品种类，此法是鉴定未知来源肉制品肉品种类的有效手段，对于不知道种属的肉品不会出现漏检或者无法检出的情况。但是，RAPD技术易受到模板的质量，引物序列等各种因素的影响导致重复性差，并且其检测过程复杂，技术要求高，最终结果必须结合常规方法再鉴定。

1.7PCR-DHPLC法

DHPLC（denaturing high performance liquid chromatography）变性高效液相色谱，是含有专门DNA分离柱的液相色谱系统。可以实现对不同大小DNA片段的分离。PCR-DHPLC法检测肉及肉制品中动物源性成分时，样品DNA经物种特异性引物PCR扩增后，产物用DHPLC按照不同碱基长度洗脱分离，比较目标色谱峰的有无来判断是否含有该种动物源性成分。

王秋燕［13］等建立了肉及肉制品中牛源性成分的PCR-DHPLC检测体系，得到了牛源性成分PCR-DHPLC的特征峰型图，可用于检测样品中的牛源性成分，并具有良好的特异性和灵敏度。

PCR-DHPLC技术实现了动物源性成分检测的高通量和自动化。但该技术对PCR扩增的严谨性、特异性要求较高。PCR产量不足特异性差时，DHPLC易形成异常峰型，色谱图常不易判断。

1.8微卫星标记检测法

微卫星DNA是一段包含单拷贝DNA侧翼的简单重复模块串联组成的长达几十个核苷酸的重复序列。微卫星常被作为优良的遗传标记而得到广泛应用。

利用微卫星标记检测食品中动物源性时，首先在Genebank中选出各物种的微卫星标记，并在其侧翼序列设计特异性引物，经PCR电泳法检测是否有目的微卫星扩增来实现检测目的。郑新等经过实验筛选了适合鉴别猪、牛、山羊、绵羊、鸡、鸭、鹅动物源性的微卫星标记DNA。并利用微卫星标记技术成功检测了肉及肉制品中的多种动物源性成分［14］。

微卫星标记技术方便快捷，特异性高，适合大批样品的检验。并且相比较其他分子标记（RFLP，AFLP，RAPD），微卫星可提供更多的多态性，针对物种来源日益丰富的肉制品市场，微卫星标记技术是一种新型的，具有相当市场应用前景的肉品来源鉴别技术，但该技术需要丰富的微卫星数据库。

2　基于分子杂交的检测方法

基因芯片检测是将固定后的探针与样品核酸分子在合适的条件下进行杂交，通过检测杂交信号的有无及强度来获取样品核苷酸序列的相关信息。

早在1995年Jacob B.Buntjer［15］等就利用该技术鉴定加热肉制品中的牛、山羊、绵羊、鹿、猪、鸡和火鸡成分，4 h内可完成50个样品的检测，准确度可达到1%。

石丰运［16］根据线粒体DNA16SrRNA基因在脊椎动物间的保守性，设计一对可以扩增牛、山羊、绵羊、水牛、鹿、驴等16个物种DNA的通用引物，然后在该引物扩增区间设计16条特异性基因芯片检测探针和两条质控探针，通过优化PCR体系和杂交体系，建立了同时检测样品中16种动物源性的基因芯片检测技术，其检测的准确性与普通PCR电泳法符合率达到100%。

该技术实现了高通量大规模的样品检测，只需要经过一次PCR和一次杂交反应就可以检测样品的多种动物源性成分。基因芯片技术从科研实验室进入与寻常百姓生活密切相关的食品安全检测领域会有广阔的发展应用空间。但是反应体系需要优化并且芯片的制备耗时长，制作系统杂交系统和计算机检测系统到目前为止市场价格仍非常昂贵。

3　其他新型检测技术

3.1基因条形编码检测技术

基因条形码的概念最早由加拿大动物学家Paul Heber［17］于2003年提出可以用某物种的单一的小片段基因来代表该物种，就像超市中扫描条形码识别商品一样，通过快速分析一小段DNA序列来识别物种，他把这种物种鉴定技术称为基因条形码技术。线粒体COI基因因含有大量具有物种特征的单核苷酸位点，可选择作为条形编码基因［17］。

用基因条形编码技术检测肉及肉制品动物源性成分的应用近年来越来越多。邱德义［18］等以基因条形编码技术鉴别鱼肉等水产制品的物种来源，他们提取了16种样品的DNA，利用COI基因通用引物进行扩增，PCR产物经测序比对，提交DNA条形码数据库分析鉴定，简单快速鉴别出样品的动物源性成分。

基因条形码检测技术简单快速准确，但由于动物源性食品来源丰富，需要丰富的数据库作为支撑。对于多成分加工肉制品还需要辅助条形编码基因的辅助才能准确鉴别。该技术成熟的关键是选择和评价合适的物种条形码，丰富数据库，另外也依赖于PCR产物回收和测序技术的提高。

3.2LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）环介导等温扩增检测技术

环介导等温扩增是一种恒温核酸扩增方法，它针对靶基因6个特异性序列设计内外两对特异性引物，加入具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，恒温（60℃～65℃）条件下进行高效快速的特异性扩增反应。

杨丽霞等将LAMP与实时荧光技术相结合建立实时荧光LAMP法检测肉制品动物源性，她在反应体系中加入SybrGreenI实时检测目的基因的扩增情况，并用该技术检测牛羊肉中的猪肉成分［19］。LAMP与常规PCR相比不需要温度循环，电泳及紫外观察等过程，简单快速特异性强，只需要一台恒温装置就能完成检验，简便快捷，适合基层快速诊断。但其灵敏度高，开盖操作容易形成气溶胶污染，假阳性问题比较严重。并且引物设计也比较复杂，对技术人员要求高。

3.3RPA检测技术

RPA（Recombinase Polymerase Amplification）重组酶聚合酶扩增技术被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，它能够在15 min内进行常温下的单分子核酸扩增。该技术可以实现单分子的核酸检测，对于低含量DNA检测效果理想，能够将痕量的DNA模板扩增到可以检出的水平，从单个核酸分子到扩增产物；并且在恒定常温（37℃～42℃）下既可以完成检验，不需要复杂昂贵的温控设备，对DNA检测的普及和现场检验意义重大。

此技术相比较LAMP繁琐的引物设计，优势更为明显，现已应用到转基因植物的检测等方面［20］。对与检测肉及肉制品中动物源性成分，目前鲜有此方面的报道。

4　结论与展望

任何一个良好的分子生物学检测方法都应满足通用性，特异性，灵敏性和稳定性。在此基础上，追求高通量，低成本的检验方法。每一种方法都有其相对的优缺点，在操作中可以根据实际情况进行选择。科研实验室可致力于简单高效的物种鉴定试剂盒的开发，质检领域面临种类繁多、成分复杂的肉品种类可充分总结经验，优化前处理，提取高效的DNA样品，互相学习补充，提高肉类掺假的检验能力，为人类造福。关注其他领域的新技术，学会转移应用和创新开发更多更精准有效的定量检验新技术，任重而道远。

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Research Progress in Nucleic Acid Test for Animal-derived Material in Meat and Meat Product

SHI Pan-pan，LI Xu，WU Hao，CHEN Lei
（Institute of Products Quality Supervision and Inspection in Henan Province，Zhengzhou 450000，Henan，China）

Food is the first thing for people and safety is the first thing for food.Meat is of great importance in people's life，which provide rich protein，fat and vitamin B for people's life.Earnings driven，food adulteration often occurs in the meat industry，which seriously undermined interests of consumers and the adverse impact for social and economic loss is very serious.So it is of great significance to carry on tests and studies about meat and meat products.This article analysed the nucleic acid inspection technique about animal-derived material in meat and meat product deeply and gave a brief introduction to some new technique which is showing extensive prospect.

meat and meat product；ingredients of animal origin nucleic acid detection technology；polymerase chain reaction（PCR）

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.052

石盼盼（1987—），女（汉），助理工程师，硕士，研究方向：食品检验。

2015-03-08