控制家禽血凝-血凝抑制试验质量的因素以及解决方法

吴春梅张陈亮顾晓明（江苏省盐城市亭湖区动物卫生监督所 224002 浙江温州科技职业学校）



控制家禽血凝-血凝抑制试验质量的因素以及解决方法

吴春梅①张陈亮②顾晓明①
（①江苏省盐城市亭湖区动物卫生监督所 224002 ②浙江温州科技职业学校）

血凝一血凝抑制试验因其具有简便、快速、准确、实用的优点，被广泛应用。但在试验过程中，人为因素的影响很大，常常因为操作不规范等，导致试验结果不准确，甚至失败。因此，做此试验前，应综合各类文献中所提及的注意事项，结合以往操作经验，避免在试验过程中犯下极易发生的错误以及任何有可能导致结果偏差的细小错误。

血凝(Hemagglutination Test，HA)与血凝抑制试验(Hemagglutination Inhibition Test，HI)试验是检测家禽A类疾病(新城疫和禽流感等)的常规方法，也是检测家禽免疫抗体水平、检查免疫效果的一种基本方法。该试验方法具有经济、反应迅速可靠、操作简便和对抗体水平进行量化的优点，能够处理大量的样品，是一种在基层临床实践中极易推广的检验检疫手段与诊断方法[1]。但试验结果受操作技术的影响很大，因此试验时必须精心操作，注意试验过程中的质量控制十分关键。

1 血样的采集和处理

（1）采血在血清学检测和实验研究中是一项前提性工作，采血质量的好坏，直接影响能不能进行实验和判定实验结果[2]。采血时，采血者除认真做好自身防护工作，采血设备需经消毒干燥，做到无菌采样。（2）分离血清的血液，试管要静置、斜放，便于血清析。温度在23℃以上时，血样在2h内即可析出清亮的血清。若温度为10℃左右的时候，最好立即放入37℃培养箱中孵育2～3h。在送样过程中，血样不可剧烈摇晃以免溶血，送至实验室后要立即分离血清，不能立即分离的血样要及时冷藏。如血清样品有溶血、胶胨样现象时应弃去。（3）家禽中，除鸡外，有些禽(如水禽、鸽子)血清可能对鸡红细胞产生非特异性的凝集，造成假阳性反应。可用待检血清做血凝试验，如果待检血清出现凝集红细胞的现象，则说明有非特异凝集素存在，需用鸡红细胞进行吸附。方法:取5%～10%鸡红细胞与等量水禽血清混合30min，取上清液做HI试验。结果判定时比原方法高一个滴度。因此在血凝抑制试验中应按照病毒种类和血清来源采取相应的处理方式。

2 试剂配制和使用时注意事项

2.1 红细胞悬液 源于不同个体鸡只的红细胞对病毒的敏感性不同。所以应采集3羽以上成年SPF公鸡或非免疫的健康公鸡的混合血液制成红细胞悬液。若采集的是免疫过鸡的血液，充分洗去血浆。在最后一遍洗涤后，充分吸弃红细胞的上清液，保证红细胞浓度。红细胞悬液的浓度对于血凝抑制效价也有影响。红细胞浓度低，血凝抑制效价就会下降；反之血凝抑制效价就会上升，红细胞浓度以0.5%～1.0%为宜。适宜的转速和离心时间以2000r/min的速度离心，第1、2次3min和第3次5min离心为宜。不合格的红细胞悬液不能使用，可以通过观察血沉质量等方法判断是否合格。建议使用与血清来源相同的禽种红细胞，以避免易产生非特异现象[3]。做同一试验或测同一批样品不能更换红细胞。一般正确保存3d的红细胞不会影响检测结果。但也有研究表明保存6个月的鸡红细胞与试验时现配的鸡红细胞在HA与HI试验中结果无差异[4]，所以可以根据实际情况决定。在试验过程中，加入红细胞悬液时应先将其轻轻充分摇匀，以免每孔中加入的红细胞悬液浓度不同，造成差异[5]。

2.2 稀释液的选择 在血凝抑制试验中，最常用的稀释液为灭菌的生理盐水、磷酸盐缓冲液(pH值为7.0～7.2的PBS)和巴比妥缓冲液(pH值为7.2的VBS)。病毒的血凝性最适pH值为6.0～7.2。当pH值<5.8时，红细胞易发生溶血；当pH值>7.8时，吸附于红细胞上的病毒易脱落。此外，缓冲液对其他酸碱物质具有一定的缓冲能力，有维持反应体系pH值的作用，而生理盐水不具备缓冲功能，一般不推荐使用。因此稀释液一般首选0.01mol/L、pH值7.0～7.2的等渗磷酸缓冲液(PBS)，以免其pH值对试验产生影响。

2.3 4个血凝单位抗原的影响 4个血凝单位抗原准确制备也是血凝及血凝抑制试验过程中的重要环节，当抗原浓度高时，HI抗体效价就会降低，反之则会有所升高。为保证4个血凝单位抗原的配制准确无误，须做抗原回归试验。若前2孔完全凝集(第2孔为完全凝集的终点)，则视为抗原配置正确。4个血凝单位抗原需现配现用。需用时混匀，配好的工作抗原室温下不可长时间放置，且不可反复冻融。如检验样品过多，工作抗原添加时间较长最好放在冰上，以免抗原失效。

3 器材的选择和使用

（1）所用器材主要有单道、多道可调微量加样器、微量反应板、吸头等。试验中使用的反应板应清洁、内壁光滑、无磨损。使用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物，然后浸泡在清洁液中(新反应板可直接放入清洁液中浸泡)，24h后取出，用流水冲洗干净后，再在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，70℃以下烤干备用。吸头经超声波清洗、高压灭菌后可反复使用，使用一段时间后要淘汰、及时更新。微量反应板、吸头的清洗比较繁琐，容易有残留，最好尽量使用合格的一次性产品。（2）单道、多道可调微量加样器在使用前或使用一些时间后均应进行校正或鉴定，使用时规范操作。在使用微量移液器时，每个吸头要安装牢固，防止漏气。稀释血清时，在吸取第l孔时要先按下移液器，再插入凝集板孔，吸取后加入第2孔，在反复抽取过程中，移液器滴头不要离开液面，防止产生气泡。在使用微量移液器时，手压下的力度要均匀，防止移液量不准。在使用移液器滴加液体时，有时会使管嘴与凝集板孔接触造成样品交叉。因此，在使用移液器时一定要保持移液器吸头垂直加入液体，保持管嘴与凝集板孔间的距离，保证每个凝集孔内液体数量和浓度准确。

4 温度控制

温度对血凝抑制试验的影响较大，从4～37℃，呈正相关。在37℃时，凝集的红细胞易洗脱；4℃以下红细胞易产生自凝。即温度过高，试验结果出现快，但凝集解脱也快，使凝集现象消失；温度过低，试验结果出现慢。故试验环境温度应控制在室温20～25℃。时间控制在红血球对照完全沉淀的前后5min内判定试验结果较好，大约在30～40min左右。也不要将反应板放置于风扇、空调或风机出风口，以免液体挥发较快，影响试验结果[6]。

5 结果判定注意事项

（1）血凝抑制试验的结果判定，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。除了受到温度，反应时间，以及样品试剂质量等客观因素的影响，还受到人为主观判定的影响。比如在对照相对较为标准合理的情况下，会发现在终点判别上，有时会很模糊，血红细胞有时只有红点无泪滴，或是有些轻微挂，或是红细胞完全凝集，判别效价或滴度值是在温度(最适温度20～25℃)控制稳定，反应时间充足合适，以及样品试剂质量都合格的情况下(这些客观因素可控性较强，很容易把握)，并在红细胞对照出现完全沉淀、病毒对照出现完全凝集的情况下，操作者应根据对照选择无泪滴红点或是红细胞完全凝结的一孔作为该血清的血凝抑制滴度。关键是操作者应该统一标准，即若以红细胞完全凝集为最终效价，则从开始到最后一板的判定读数均以此为标准，这样可以消除系统误差，增强结果的标准性。读数者不应被更换，这也是为消除主观判定影响的措施之一，因不同人读数标准会有差异。若检测量不是很大，或人力安排允许，做重复，在最大限度的避免了客观因素和主观因素所造成影响的情况下，血凝抑制试验的结果相对还是比较稳定的，具有可重复性。（2）血凝抑制试验试验成功与否的判断要素：阳性血清不超过标准值的±1个滴度，阴性对照血清在2log2以下时为100%凝集；空白对照液体清亮，红细胞流淌良好(100%阴性)；抗原回滴时结果准确。若病毒对照孔没有完全凝集，生理盐水对照孔没有完全沉淀，那这块反应板就被认为试验失败，结果应弃之不用，样品要重新加样检查。

6 其他加样细节和技巧

将抗原血清稀释后，加4个血凝单位抗原以及红细胞悬液时，可由11孔开始往前加，这样可避免由于枪头沾染孔内样品而造成的误差。因后一孔的浓度对于前一孔而言相对较低，即使沾染一点也不会造成太大影响，从而增加了结果的准确性。

7 小结

综上所述，在血凝抑制试验中，影响试验结果的因素很多。因此，做试验前，应综合各类文献中所提及的注意事项，结合以往操作经验，严格遵守各项操作规程，耐心细致地做好每一个环节，并在一些操作技巧和熟练程度上苦下功，发现问题及时纠正处理，保证试验结果的准确，从而准确评价家禽免疫的效果[6]。

参考文献

[1] 王孟华. 浅析影响血凝和血凝抑制试验的因素[J]. 福建畜牧兽医, 2004, 26(6): 51-52.

[2] 许勇团. 鸡的血液和病料采集技术[J]. 中国畜牧兽医文摘, 2014, 30(6): 50-51.

[3] 顾俐敏, 毛裕新, 叶明等. 异种家禽红细胞对禽流感抗体检测的影响[J]. 上海畜牧兽医通讯, 2011(4): 40-41.

[3] 李风华, 张正飞, 肖显悦等. 血凝和血凝抑制试验在家禽生产养殖中的应用影响因素及解决方[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2010(2): 34-35.

[4] 高思汉. 保存红细胞与现配红细胞在血凝与血凝抑制中的对比试验[J]. 福建畜牧兽医, 2008, 30(6): 20-21.

[5] 陶景莲. 新城疫血凝和血凝抑制试验(HA/HI)中红细胞浓度对结果的影响[J]. 上海畜牧兽医通讯, 2012(3): 51.

[6] 庄金秋, 梅建国, 王艳. 禽蛋卵黄抗体检测中影响血凝抑制试验结果的因素分析[J]. 家禽科学, 2014(8): 50-54.

收稿日期：（2015–12–07）

中图分类号：S8452.4+5

文献标识码：A

文章编号：1007-1733(2016)03-0056-02