单纯疱疹病毒性角膜炎对角膜表层上皮细胞的影响*

西安市第一医院眼科(西安710002)

王小东 程 钰 李宏松 赵俊宏



单纯疱疹病毒性角膜炎对角膜表层上皮细胞的影响*

西安市第一医院眼科(西安710002)

王小东 程 钰 李宏松 赵俊宏

目的：通过活体共聚焦显微镜观察单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)患者角膜表层上皮细胞变化及其与角膜神经知觉关系的相关性。方法：诊断单眼HSK的非急性期复查患者50例(100只眼),和50例未患过HSK健康体检者(100只眼)。行角膜知觉、活体共聚焦显微镜检查并对共焦显微镜图像进行分析、记录。结果：HSK患者患眼角膜表层上皮细胞数为1287.78±102.54 cells/mm2,其密度显著低于对侧眼角膜表层上皮细胞数的2425.18±202.13 cells/mm2和健康对照者角膜表层上皮细胞数2435.23±224.3 cells/mm2(P<0.05)。HSK患者患眼角膜表层上皮细胞面积为606.62±198.23 mm2,较对侧眼角膜表层上皮细胞面积415.36±58.13 mm2和健康对照者角膜表层上皮细胞面积409.21±63.20 mm2,显著增大,差异有统计学意义(P<0.05)。HSK患者患眼角膜知觉正常8例(8只眼),角膜知觉轻度异常34例(34只眼),角膜知觉重度异常8例(8只眼),角膜知觉度与HSK患者的角膜表层上皮细胞密度呈负相关(r=-0.90,P<0.05),与HSK患者的角膜表层上皮细胞面积呈正相关(r=0.81,P<0.05)。结论：HSK导致角膜表层上皮细胞密度降低,通过细胞体积增大来代偿,这些改变与角膜神经功能改变密切相关。

单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)是临床上最常见的致盲性角膜感染性疾病,其病程长、易反复,在发达国家亦是单眼失明的最常见的感染原因[1]。单纯疱疹病毒(HSV)感染角膜细胞诱导炎症反应,严重损伤角膜,并且HSV可以潜伏在神经节细胞或角膜细胞,从而反复发病[2]。HSK临床分为四型,分别为上皮性角膜炎,坏死性基质和免疫性角膜炎,角膜内皮炎,神经营养性角膜病变;其中神经营养性角膜病变临床表现为持续性角膜上皮缺损,视力下降,角膜基质混浊,角膜新生血管,间质融解[3]。所以对HSK发病机制的研究就显得尤为重要。本文着重研究HSK对角膜表层上皮细胞的影响,以及角膜表层上皮细胞的变化与角膜神经的关系。

对象与方法

1 研究对象 连续收集2015年1～12月我院门诊诊断单眼HSK的非急性期复查患者50例,男38例,女12例,平均年龄44.95±11.14岁,患病时间3.1±6.78年，将50只患眼，纳为HSK组,其对侧50只未患病眼为对侧对照组。同期50例未患过HSK健康体检者(100只眼)为健康对照组,男35例,女15例,平均年龄41.45±11.42岁。HSK患者的纳入标准：①单眼发病患者；②非急性期发病患者；③具有良好的医从性，按时复诊患者；排除标准：①患糖尿病者；②患类风湿、免疫系统疾病者。健康对照组纳入标准：①既往未患HSK者；②目前无眼表疾病症状、体征；排除标准：①患糖尿病者；②患类风湿、免疫系统疾病者。

2 研究方法 ①角膜知觉检测：将一块消毒棉花搓成尖形条,用其尖端从眼的侧面或下方轻触角膜表面。评价标准：知觉正常,立即发生反射性瞬目运动；知觉轻度异常,发生反射性瞬目运动迟钝；知觉重度异常,无何反射性瞬目运动。②共焦显微镜检查：检查前点奥布卡因表麻眼液1次，开睑器开眼睑，使用海德堡全自动共焦显微镜检测，检测头涂少许卡波姆凝胶，按米字形从周边向中央进行扫描,检查并记录角膜表层上皮细胞，上皮下神经纤维丛。③共焦显微镜图像分析：使用海德堡全自动共焦显微镜自带图像分析软件,对每例患者100帧图像进行分析记录平均值，计算角膜表层上皮细胞数，角膜表层细胞面积。

3 统计学方法 使用SPSS 17.0统计软件进行统计分析,计量资料用均数±标准差表示,两组比较使用t检验,3组样本比较分析使用方差分析,相关性分析使用Person相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

①HSK患者患眼角膜表层上皮细胞数为1287.78±102.54 cells/mm2,显著低于对侧眼角膜表层上皮细胞数的2425.18±202.13 cells/mm2和对照者角膜表层上皮细胞数的2435.23±224.3 cells/mm2(P<0.05)。②HSK患者患眼角膜表层上皮细胞面积为606.62±198.23 cells/mm2,较对侧眼角膜表层上皮细胞面积415.36±58.13 cells/mm2和对照者角膜表层上皮细胞面积409.21±63.20 cells/mm2,显著增大(P<0.05)。③将HSK患者患眼按角膜知觉检测分为3组，角膜知觉正常组8例(8只眼),角膜表层上皮细胞数为1628.33±348.12 cells/mm2,角膜表层上皮细胞面积为330.25±216.23 cells/mm2；角膜知觉轻度异常组34例(34只眼),角膜表层上皮细胞数为1382.50±73.55 cells/ mm2,角膜表层上皮细胞面积为654.30±328.15 cells/ mm2；角膜知觉重度异常组8例(8只眼),角膜表层上皮细胞数为852.50±24.40 cells/ mm2,角膜表层上皮细胞面积为835.30±50.30 cells/ mm2。角膜知觉度与HSK患者的角膜表层上皮细胞密度呈负相关(r=-0.90，P<0.05),与HSK患者的角膜表层上皮细胞面积呈正相关(r= 0.81，P<0.05)。

讨 论

角膜上皮作为一种屏障,有助于保持角膜的透明性,任何对角膜上皮造成的损害,都可使角膜基质肿胀、基质成纤维细胞的活化及炎性细胞浸润,导致角膜透明度的丧失[4]。对角膜上皮细胞的健康评估,直到最近通过共焦显微镜检查才变为可能。共焦显微镜可以使我们更好的对角膜生理特性和稳态进行理解,并且可以对角膜上皮细胞的形态学特征在正常人和患者间进行比较研究。Benitez del Castillo等[5]对干眼症患者的研究，Roszkowska等[6]对结节状角膜变性的研究,Gabbriellini等[7]对Sjogren’s综合征的研究,也有与我们相同的发现,角膜表层上皮细胞数减少，细胞面积增大,认为角膜上皮细胞大小和形态的改变是细胞的快速更新和不典型修复[8]。本研究与Rosenberg等[4]对HSK患者角膜表层上皮细胞改变研究的发现相同，他们也发现上皮细胞肿大,但他们的结果没有量化,并且没有发现上皮下神经丛的任何变化。本研究发现角膜表层上皮细胞密度和形态特征与角膜知觉的变化密切相关,并且发现HSK患者患眼角膜上皮下神经丛分布较对侧眼和正常对照组减少或缺失，角膜上皮下神经丛的改变与角膜知觉改变一致,角膜知觉障碍严重的患者,角膜上皮下神经丛分布稀疏,但由于神经丛测量标准问题,本研究未进行统计学分析。鉴于表层上皮细胞参数与角膜知觉和神经支配的强相关性,本研究结果表明,不仅感觉丧失,而且角膜表层上皮的变化,可能是HSK患者上皮下神经丛减少的直接结果。感觉神经对角膜上皮完整性的维护起着重要的作用。众所周知，角膜上皮细胞的内稳态是由紧缩调控细胞凋亡和增殖的生理控制，神经营养性角膜病变扰动它们之间的平衡，最近的研究表明，去神经对角膜上皮细胞的凋亡有不利的影响，并诱导上皮细胞有丝分裂的减少[9]。部分或完整的角膜感觉神经受损或缺失可导致影响角膜上皮细胞和角膜上皮细胞有丝分裂的神经肽(包括P物质、神经生长因子、血管活性肠肽和胰高血糖素样肽)缺乏，打破角膜上皮稳态，上皮细胞受损。

总之，共焦显微镜可以直接的和可重复性的比较上皮细胞的形态学特征。临床体征出现前，检测亚临床上皮细胞的变化可以客观的定量的评价上皮细胞的健康状况。由于神经营养性角膜病变可能会发展为角膜穿孔并且缺乏最初的症状和体征,共焦显微镜对HSK患者角膜表层上皮细胞密度及形态特征监测就显得尤为有价值，而且可预测潜在的神经病变的风险。共焦显微镜可以通过对角膜细胞特性的检测,客观的评价治疗效果,为神经营养性角膜病治疗研究提供了有效的方法。

[1] Solanki S, Rathi M, Khanduja S,etal. Recent trends: Medical management of infectious keratitis[J].Oman J Ophthalmol, 2015, 8(2):83-85.

[2] 吴甦潜,徐建江.单纯疱疹病毒性角膜炎的发病机制[J].中国眼耳鼻喉科杂志, 2014, 14: 330-332.

[3] Seitz B, Heiligenhaus A. The Chameleon of Herpetic Keratitis-Diagnosis and Therapy[J].Klin Monbl Augenheilkd, 2015, 232(6):745-753.

[4] Rosenberg ME, Tervo TM, Muller LJ,etal. In vivo confocal microscopy after herpes keratitis[J]. Cornea, 2002, 21:265-269.

[5] Benitez del Castillo JM, Wasfy MA, Fernandez C,etal. An in vivo confocal masked study on corneal epithelium and subbasal nerves in patients with dry eye[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2014, 45:3030-3035.

[6] Roszkowska AM, Aragona P, Spinella R,etal. Morphological and confocal investigation on Salzmann nodular degeneration of the cornea[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011,52:5910-5919.

[7] Gabbriellini G1, Baldini C, Varanini V,etal. In vivo confocal scanning laser microscopy in patients with primary Sjogren’s syndrome: A monocentric experience[J]. Mod Rheumatol, 2015,25(4):585-589.

[8] Alomar TS, Nubile M, Lowe J,etal. Corneal intraepithelial neoplasia: in vivo confocal microscopic study with histopathologic correlation[J]. Am J Ophthalmol, 2011, 151:238-247.

[9] Ferrari G, Chauhan SK, Ueno H,etal. A novel mouse model for neurotrophic keratopathy: trigeminal nerve stereotactic electrolysis through the brain[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2011,52:2532-2539.

(收稿：2016-02-28)

The morphologic features of corneal superficial epithelial cells and keratocytes in patients with herpes simplex keratitis

The No.1 Hospital of Xi’an(Xi’an 710002)

Wang Xiaodong Cheng Yu Li Hongsong et al

Objective: To analyze the morphologic features of corneal superficial epithelial cells and keratocytes by in vivo confocal microscopy in patients with herpes simplex keratitis (HSK) as associated with corneal innervation. Methods:We continued collecting 50 cases (100 eyes) with non acute period HSK who treated in our hospital and 50 healthy cases (100 eyes) at same time. Changes in morphologic features and density of the superficial epithelial cells, were assessed by 2 masked observers. Changes were correlated to corneal sensation. Results: There was a significant decrease in the density of superficial epithelial cells 1287.78±102.54 cells/mm2in HSK eyes,2425.18±202.13 cells/mm2in contralateral eyes and 2435.23±224.3 cells/mm2in normal eyes (P<0.05). Superficial epithelial cell size was 2.5-fold larger in HSK eyes (606.62±198.23 mm2) compared with contralateral (415.36±58.13 mm2) or normal eyes (409.21±63.20mm2;P<0.05). Changes in superficial epithelial cell density(r =- 0.90)and morphologic features (r = 0.81)correlated strongly with corneal sensation(P<0.05).Conclusion：In vivo confocal microscopy reveals profound HSK-induced changes in the superficial epithelium, as demonstrated by increase in cell size, decrease in cell density, and squamous metaplasia. This study demonstrated that these changes correlate strongly with changes in corneal innervation.

Keratitis,herpetic Cornea Epithelial cells Microscopy,confocal

*陕西省科学技术研究发展计划项目(2014K11-03-07)

角膜炎,疱疹性 角膜 上皮细胞 显微镜检查,共焦

R772.21

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.046