液氮冷冻制备犬早期股骨头坏死模型研究进展

王 安，谭 波 综述，王 跃△ 审校

(1.四川医科大学研究生院2013级，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院.四川省人民医院骨科，四川 成都 610072)

△通讯作者

液氮冷冻制备犬早期股骨头坏死模型研究进展

王 安1，谭 波2综述，王 跃2△审校

(1.四川医科大学研究生院2013级，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院.四川省人民医院骨科，四川 成都 610072)

随着MRI技术的进一步发展使得股骨头坏死的早期诊断成为可能，青壮年因股骨头坏死而行人工髋关节置换术的失败率比因其他原因而行关节置换的病例高，故在采用人工关节置换术之前，应选择保留股骨头的姑息性治疗以延缓或替代髋关节置换。如何在软骨下骨塌陷之前阻止病程进展。股骨头坏死动物模型的建立是否成功对实验结果的可靠性有着重要意义。本文就近年来国内外动物模型制作的方法进行综述 。

股骨头坏死；动物模型；研究进展

股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)是一种进展性疾病，往往会在患者20～50岁这一阶段症状明显，影响生活质量[1]。据估计，在美国每年有10000～20000名新发病例，如果不给予治疗，将逐步导致髓关节的完全破坏。MRI技术的进步使得股骨头缺血性坏死的早期诊断成为可能，还可以通过无创手段准确地进行分期并确定坏死范围。这样可以发现早期病变，很多治疗方法都是在疾病早期更有效。骨坏死在软骨下骨塌陷之前早期自然进程尚不清楚，但有证据表明其进展很快，特别是有症状的患者。无症状的骨坏死患者若病变范围小于股骨头的30%，那么95%的患者可以继续维持无症状达5年以上；但随着病变范围的增加，骨坏死患者出现疼痛症状的百分比增加。一旦发生软骨下骨塌陷、关节间隙消失，进行性骨关节炎就不可避免。许多研究证明本病预后很差，有症状的患者(Ⅰ或Ⅱ期)2年后股骨头塌陷率极高[3]。所以建立股骨头坏死动物模型对研究ONFH的预防措施、发病机制、治疗策略都有着重要的意义。

1 液氮冷冻制备犬股骨头坏死模型特征、基本原理及病理基础

理想的股骨头缺血性坏死动物模型除了要求与人类的股骨头缺血性坏死有相似性和可比性外，还应具备以下几个特征: ①符合人类股骨头坏死病变的病理过程； ②模型有良好的可重复性； ③动物的解剖和生理特点尽可能与人类相似； ④经济可行[4]。灵长类动物解剖及生理特点与人类近似，是制造股骨头缺血性坏死模型最理想的动物。但是由于灵长类动物存在驯养困难、费用昂贵、实验周期较长等问题，影响了它们的使用。而犬的解剖和生理特点与人类相似、温顺听话、费用适中、实验周期短[5]。

其理论依据主要包括两个方面：首先液氮冷冻可直接损伤骨细胞、骨髓间充质细胞；其次低温造成血管痉挛、血管内皮细胞受损、血管内凝血、血管通透性增加，继而发生出血和复温后的缺血再灌注损伤，进一步诱发血栓形成，冷冻区域血供减少，加重骨细胞的损伤、骨质的坏死[6]。髋关节脱位会进一步伤害股骨头周围的血管，就更像人类的ONFH的过程[7]。通过研究发现脱位和液氮制冷相结合的方法有两个主要优势：首先，它没有残留的化学物质，也不会影响细胞动脉灌注治疗期间，这是不同于其他化学方法；第二，它有短时间模型建立，成功率高、死亡率低的动物和良好的重现性。液体氮和位错导致完整的股骨头坏死瞬变，同时允许逐步修复过程，适用于我们的血管修复和血管生成研究股骨坏死的头上。然而，狗作为ONFN的动物模型有不同于人类固有生物力学特性的缺点。因为狗是一种四足动物，它可以改变负载的四肢，然后改变机械环境机制过程中骨修复[8]。徐俊等[9]将克氏针固定于犬的腕掌关节，并将克氏针埋于皮下，使犬适应三足行走，建立三足动物模型，使其骸关节机械应力符合人类病理过程。

2 液氮冷冻建立犬股骨头坏死模型制备方法

液氮冷冻制备犬股骨头坏死模型大体可分为三种:骨外部分冷冻、骨外全头冷冻、骨内冷冻，同时伴或不伴股骨头脱位及其周围血管破坏。这三种方法对与犬股骨头坏死骨内外损失各有优缺点，不同的实验对与犬模型的选择也有所差异。

2.1 骨外部分冷冻制备犬股骨头坏死模型 即为使用浸过液氮的棉签或纱布接触动物股骨头负重区表而，冷冻损伤由软骨而向骨质深而传导。早在20世纪80年代Takaoka[10]就成功采用液氮冷冻法建立动物模型，其后液氮冷冻法被国内外学者广泛用于不同的研究[11，12]。顾晓峰等[13]采用12只健康成年犬，剪断圆韧带脱出股骨头颈，用浸透液氮棉球或纱布湿敷股骨头，时间为3 min。第7周可见承重区略有塌陷，于11周X射线发现股骨头负重区软骨下骨明显囊性变及承重部软骨明显塌陷，但软骨面完整，病理切片示造模术后11周见致密结缔组织，伴有骨样组织出现。

单纯冷冻比较适用于较小的动物[14，15]，但体型较大的动物，仍难以模拟出十分理想的股骨头缺血性坏死动物模型。顾晓峰等采用液氮冷冻法结合血管破坏法的优点，所需时间短，坏死塌陷成功率高，动物死亡率低，但股骨头修复组织是一种不够成熟的骨组织，其机械强度较差，在 “爬行替代” 的过程中容易在负重部位发生塌陷，可用于模拟坏死晚期临床治疗和刮除死骨后的植骨研究。想模拟早期股骨头坏死，还有待对冷冻时间和血管破坏程度等方法进一步研究。

2.2 骨外全头冷冻制备犬股骨头坏死模型 通过剪断圆韧带完全暴露股骨头，周围用干纱布充填，以保护股骨头周围组织，再用液氮完全浸泡股骨头。朱建龙等[16]采用暴露股骨头，股骨头周围用干纱布充填，以保护股骨头周围组织。用一铁制漏斗套于股骨头，将100～150 ml液态氮倒入漏斗内，并维持冷冻3 min，用37 ℃温盐水将股骨头复温。造模后4周可见实验侧股骨头内于T1W上出现均质低信号，T2W信号升高，STIR信号升高更为明显，呈散在、点状分布于股骨头内，关节腔内可见少量关节积液； 股骨头形态规则，边缘光滑，大小与对侧正常的股骨头一致。造模后8周实验侧股骨头内 T1W 低信号，T2W略高信号，STIR略高信号； 关节腔内积液，股骨头边缘不规则，变扁，变小，股骨头碎裂明显塌陷。张怡元等[17]采用此方法行实验研究，术后4周模型组呈早期ONFH表现，股骨头外形规则，股骨头区密度降低，髋关节结构尚好。术后8周模型组坏死骨质范围有所增加，股骨头区密度进一步降低，出现囊性改变。术后12周模型组出现瘢痕软化，MRI信号持续减弱。术后24周模型组呈明显ONFH表现，股骨头区域密度不均一，负重区存在囊性改变，股骨头塌陷。

此类方法经过改良避免了原方法因纱布块与股骨头冻结造成即刻的股骨头软骨面人为损伤。液氮直接浸泡股骨头部位冷冻效果可靠，冷冻时间可控性强，由于缩短了冷冻时间，并且周围衬以泡沫保护，有效减少了周围组织的副损伤。但破坏了股骨头几乎全部血液供应，修复反应受到抑制，在外力的作用下。坏死区支撑力不足，软骨发生塌陷，快速出现典型的股骨头缺血性坏死塌陷模型，也可用于模拟坏死晚期临床治疗，通过刘国柱等改良后，可延缓塌陷时间，仍难以符合早期股骨头坏死模型标准。

2.3 骨内冷冻冻制备犬股骨头坏死模型 通过不破坏圆韧带显露股骨头通过大转子或头颈交界转孔，将液氮注入，从骨内进行冷冻。龚跃昆等[18，19]采用双侧髋关节外侧切口，剥离软组织，显露股骨头。 在股骨头头颈交界处钻孔，刮除约50%的松质骨。用干纱布保护周围软组织，用漏斗将液氮灌入股骨头髓芯并维持1 min，待股骨头自然复温后复位。术后3、6及12周都未出现股骨头脱位，股骨头表面光滑、无塌陷、外形规则，关节液数量及颜色未发现明显异常。组织学表现在术后3及6周时原缺损区内及软骨下骨的坏死骨小梁的髓腔内纤维组织长入，结缔组织内间充质细胞含量极少；术后12周缺损区为致密结缔组织，伴有骨样组织出现，与缺损壁结合疏松，缺损壁硬化骨形成。

此类方法既避免软骨面人为损伤又加强对股骨头血供破坏的可选择性，术后12周无塌陷且外形规则，股骨头骨缺损仍然存在，进一步证明所建立的液氮冷冻犬股骨头缺损坏死可作为模拟临床股骨头早期坏死，对植骨及多孔棒等治疗的研究提供动物模型。

2.4 冷冻制备犬股骨头坏死模型进展 徐俊等[20]通过计算机辅助采用FLUENT6.2 软件对探针置入股骨头后内部温度场分布进行三维有限元分析，设计出可最大化ONFH面积，最小化周围组织损伤的低温手术。在C臂X射线机引导下，自股骨大粗隆向股骨头打直径2.5 mm骨隧道，至关节软骨面下2 mm。骨隧道置入特制探针，同时置热电偶于股骨头表面，透视确认位置满意后，0.5 MPa液氮冷冻6.5 min，复温5 min至2 ℃，再次冷冻6.5 min。取出探针，骨蜡封闭骨槽，关闭伤口。于术后1 周后病理组织学观察，实验组股骨头髓腔内有核细胞死亡，局部血管破裂。术后8周未见明显变形，术后12周的X射线片和MRI均显示股骨头轻度变形，囊性变，股骨头内部密度不均，呈典型的 Ficat Ⅲ期改变。Wang D等[21，22]使用氢氦刀靶向冷冻系统制备犬股骨头坏死模型，是一种微创低温冷冻消融肿瘤的医疗设备。它通过MRI进行定位引导，将氢气刀准确穿刺进入到组织内，然后启动氢气，氢气在刀尖可迅速冷却至-170～-140 ℃。将该系统应用到制备动物股骨头坏死模型上，可在不脱位髓关节的情况下，通过MRI引导下准确定位股骨头区域，对该区域实行冷冻一复温，彻底摧毁骨质细胞和血管从而造成股骨头坏死，同时采用12只健康成年犬进行实验，造模后8周未出现塌陷，在造模后12周X射线和MRI出现囊性变及塌陷等坏死表现。官建中等[23，24]通过建立幼犬股骨头坏死模型模拟儿童股骨头坏死(Perthes病)。采用10只1月龄健康杂种犬，手术脱出股骨头，再用相当于花生米大小的纱布团蘸液氮即刻冷冻股骨头上端，持续10s，然后用温盐水复温，反复2～3次，术后8周出现较为典型股骨头坏死表现。可作为模拟临床手术清除死骨、植骨治疗研究的动物模型，较其他方法制备的模型更适合于Perthes病治疗的研究。

3 小结与展望

综上所述，液氮骨内冷冻可以较好模拟人类早期股骨头坏死，此方法可在不损失股骨头表面软骨情况下制备犬股骨头坏死，同时最大程度减速周围组织的破坏，为选择性血管结扎提供基础。总体来说，目前冷冻制备犬股骨头坏死模型向两个方向发展:第一，对冷冻器械进行改造，使液氮法制备犬股骨头坏死更加精细化、定量化、标准化。第二，根据不同的病理阶段或治疗方法制定相应的坏死模型，使液氮法制备犬股骨头坏死更加特异化。目前股骨头坏死模型整体研究为符合人类生物力学开始向双足动物[25，26]发展，股骨头塌陷的实质是一种生物力学现象，当股骨头承受的压力超过了骨结构生理负荷时，塌陷不可避免，不太适合早期股骨头坏死模型。所以在建模过程中要根据实验设计的特异性、结合生物力学及坏死病变演变的不同时期选择不同模型，是实验最终结果可靠性的前提，从而更贴近于临床实际，才能为临床治疗早期股骨头坏死提供可靠治疗方案。

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Research progress on the model of canine early stage femoral head necrosis by liquid nitrogen freezing

WANG An，TAN Bo，WANG Yue

R681.8

B

1672-6170(2016)02-0165-03

2015-09-17；

2015-12-20)