浅谈禽流感血凝和血凝抑制试验注意事项

牛 刚

浅谈禽流感血凝和血凝抑制试验注意事项

牛 刚

（河北省涿州市动物卫生监督所，河北涿州 072750）

禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态。这两种试验在实践中应用的比较多，但也容易出错，现对该试验过程中应注意的事项做一探讨。

禽流感血凝；血凝抑制试验；移液枪；保存

1 样品的保存及试验前处理

（1）采集的血液样品应及时分离血清，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运输过程中剧烈震动。

（2）一般情况下，在5d内检测的样品可放置在4℃的冰箱中冷藏，待检血清超过1周的需低温冷冻保存。

（3）在检测前血清样品应充分混匀，混匀时采用上下缓慢颠倒几次的方法即可，切忌剧烈振荡而引起产生气泡。

（4）对出现胶冻状的血清样品，要反复搅动几下再离心有助于缓解该状态。可能是由于放置时间不够造成的血清未完全析出，不建议直接吸取其中少量的清亮血清。

2 试剂的保存及配置

（1）禽流感血凝抑制试验所用的抗原应保存在-20℃，试验前应提前将其恢复至室温，反复冻融会降低抗原的滴度，应避免反复冻融。

（2）pH7.2、0.01mol/L的PBS液的制备：应尽量现用现配，不应保存太久；

每次使用前应测PH值，以免时间过长而导致PH值发生改变；不建议使用生理盐水；全部试验均采用同一种稀释液。

（3）1%红细胞的制备

为避免有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应最好选择2～3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。采血时将血液与等体积阿氏液混合，以防血液凝固。

经2000～3000r/min，5～10min，弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入PBS液，上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。

制备好的红细胞液如果放置后上清液变红，说明有溶血，不可再使用。不用的红细胞悬液应4℃冷藏，且不超过2d。

3 四单位抗原的配制

（1）四单位抗原应现用现配。先对抗原做血凝试验，以抗原和红细胞完全凝集的孔作为抗原效价，再根据抗原效价配制四单位抗原。

（2）每次做试验前，必须重新检测禽流感抗原的血凝效价，以免效价发生改变而导致抗原稀释倍数不准确，从而导致试验结果不准确。

（3）为保证配制的四单位抗原准确，还要进行回标试验。具体方法：做二排抗原回标，在第一、二排的第1～4孔各加25微升PBS，取四单位抗原25微升加在第1孔，混匀，从第2孔倍比稀释至第4孔，弃去25微升，各孔再加25μlPBS，然后各孔加25微升1%红细胞，震荡10s，静置30min观察结果。第二孔完全凝集表明四单位抗原配制准确，如果抗原回滴试验不成立，应相应调整抗原浓度直至回标试验成立。因为如果抗原浓度过高，则所测定的抗体效价水平偏低，如果抗原浓度过低，则所测定的效价偏高，所以不调整抗原浓度至回标试验成立的话会对结果有很大影响。

4 移液枪的使用

（1）使用时应采用一档吸液二档排液的方法。

（2）吸取液体时，枪头要深入液下缓慢平稳吸液。加缓冲液时应加在板孔底部。倍比稀释血清时，应每孔至少反复吹吸6次，以便混合均匀，还应注意尽量避免产生泡沫引起混合不均。加抗原及红细胞时应在板内液面上方加样，以免交叉污染，影响试验结果。

（3）加样、倍比稀释时应高度集中注意力，以免漏加、重复加样等。

5 结果的判定

每次试验必须设阳性及阴性（空白）对照血清，判别试验是否成立。判读结果时，将酶标板倾斜45°，以孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒为凝集完全抑制。

6 试验器具的清洗

每次试验完毕后，应将酶标板中液体甩净，然后用自来水反复冲净每个孔，再放入3%NaOH中4h，清水反复冲净，再放入3%HCl中4h，清水反复冲净，再用蒸馏水反复冲洗几次，甩干水份，入干燥箱中干燥备用。实验用烧杯、量筒等也应充分洗净、高压消毒、干燥，以免器具内有杂物、污物以及残留物从而影响试验结果。

7 小结

影响禽流感血凝试验和血凝抑制试验的因素很多，需要各个环节严格操作，平时多加练习，才能为实际的免疫工作提供准确的理论依据。

［1］ 王延树，张芳.血凝和血凝抑制试验操作要领［J］.中国动物保健，2009，11（8）：75-76.

［2］ 舒跃龙，王敏，张烨，等.一种敏感的H5禽流感病毒血凝抑制试验方法［J］.公共卫生与预防医学，2007，（2）：9-10.