冷冻保存技术在动物遗传资源保护策略中的潜力

侯 磊　（山东省泰安市畜牧兽医局　271000）

冷冻保存技术在动物遗传资源保护策略中的潜力

侯 磊（山东省泰安市畜牧兽医局271000）

通过冷冻保存技术对家畜的遗传物质进行异位保护是对这些物种遗传多样性保护的一种重要策略。冷冻保存技术的发展有助于保护策略的完善，不同物种遗传物质类型的选择取决于保护目标、技术可行性（如收集、冷冻保存）、成本和实际环境。

目前，家畜全球多样性正日益受到威胁。在世界范围内，大量家畜品种处于极危状态，有的品种已经灭绝。在6379个家畜品种中，处于极危状态的占9%，处于濒危状态的则占到了39% 。家畜遗传多样性的下降并亟待保护已在全世界达成共识。（1）为了满足不断变化的消费以及育种和选择的要求，家畜品种内和品种间多样性的保护同样重要。在稀有或濒危品种小的有效保种群体中，必须监测并制定计划以维持品种间多样性。尽管目前地方品种和商用品种间特异性状的渐渗杂交还十分有限，Notter就已提出：与植物一样，低产品种中也可能存在有用基因，并推荐了应用于遗传资源评价、保护和利用的系统计划。遗传多样性的保护有多种选择。总的来说，作为一种品种保护机制，原位保护或通过利用加以保护是首选，因为一个品种必须进化才能适应不断变化的环境，丰富的遗传多样性才能满足推出新产品的要求，理想的保种策略应保护有发展潜力及应用价值的种质资源。除了原位保护，还建立了一些技术或方法来保护稀有品种和应用较广的商业品种。这些方法或技术有的是在生产外维持一定数目的活体，有的是在他们的自然环境之外的地方维持一定数目的活体（异位活体），有的则是通过生殖质进行异位保护。对保存现有等位基因多样性供将来应用来说，生殖质的冷冻保存是一种很好的异位保护策略。（2）异位保护策略能满足多种目标需求，逐渐引起人们更多的关注。异位保护可代表保护的整体构成，有的策略主要集中在稀有品种生殖质的保存上，但总体来说在异位保护样品收集上达成了这样的共识：为了在保护中获得尽可能多的等位基因或遗传多样性，应该收集所有品种的样品。当动物遗传资源的原位保护或利用不依赖高科技方法或设备时，异位保护的效率和效能就必然得益于冷冻保存技术的发展。由于异位保护成本相当昂贵，对冷冻保存技术的优先次序、不同方法、未来应用和好处上仍存在争论。

本文在综述了家畜冷冻保存最新技术状态后，讨论了异位保护策略的实质。

1　冷冻保存技术状态

1.1低温生物学原理（1）低温生物学在上世纪下半叶取得了重大进展，大多是由实验研究获得。冷冻保存允许生物材料在几千年或更长的时间内不变质。近几年，冷冻生物学基础理论的发展极大地推动了学科的发展。（2）在被称为“慢速冷却”的方法中，生物材料以一定的速率范围冷却，该范围内，冷却速率既可避免慢速冷却损伤，但同时又足够慢，使细胞进行充分地脱水，防止细胞内冰晶的形成。留在冰晶中未冷冻片断中的脱水细胞最终达到稳定的玻璃化状态，或称“玻璃化”。在这种称为玻璃化的方法中，通过在冷冻前加入高浓度的抗冻剂降低细胞中水的含量，因此，一点冰晶也无法形成，整个样品呈玻璃化状态。这使得较快冷冻速率下，也不会出现危险。较高的冷却/解冻速率可使玻璃化溶液中抗冻剂的浓度最低。极高的冷却速率下，即使不加抗冻剂也可完成玻璃化。

1.2精液（1）大多数家畜的精液可成功冷冻，而且对许多家禽、家畜已有专门的冷冻介质和用于采集、分装、冷冻和人工授精的设备，这些介质和设备都可买到。已在牛的人工授精（AI）中进行了精液“耐冻性”选择，解冻后的精液品质相当好，有活力的精子可达50%～70%，若提高输精量，使用冻精获得的妊娠率或产仔率可达到鲜精的水平。对其它的哺乳类家畜，总的来说解冻后顶体质膜完整或有活力的精子百分率稍低，但对大多数物种而言，在精子成活力上差异不大。在许多动物中发现冻精的受精力要比鲜精差，这主要取决于输精部位、雌性生殖道形态、鉴别发情或排卵的能力，绵羊冻精子宫颈输精效果就比鲜精差很多，目前国外主要采用腹腔微创手术进行人工授精，受胎率能达到60%以上。精液耐冻性随品种和公畜的不同显出相当大的差异，一些遗传上特殊的品种或公畜冷冻精液也许就不适合作基因库资源，利用效率较低。（2）在家禽上，精液冷冻技术在鸡、火鸡、鹅和鸭上呈现出相同的解冻后精子活力，活精子的比例可达到60%。已有用解冻精液在主要家禽品种中进行人工授精收到良好效果的报道。但正如Hammerstedt和Graham的文章所指出的，在卵子受精率的研究上，各报道有明显的差异，结果从9%到91%不等。而且用冷冻精液在鸡上达到最高受精水平所需的精子数要比使用鲜精时高许多。（3）缓冲液在不同纲间和同纲异种间存在巨大差异。大多数缓冲液具有盐或糖的渗透性，缓冲液的适当的浓度从0.2～1.5mol/L不等。缓冲液中有众多保护性大分子添加物，多数为牛奶或卵黄成分或是植物源性的脂质成分。牛奶和卵黄主要添加到哺乳动物精液缓冲液中，这些大分子物质在冷却、冰冻和解冻时保护精子。（4）甘油作为一种适宜的抗冻剂广泛应用于哺乳动物和鸟类。但是在家禽中发现甘油可以避孕，因此家禽精液解冻后必须将甘油去除。不同物种所使用的抗冻剂差异很大，相同物种同一种抗冻剂在有的研究中效果很好，而在另一种研究中却不适合。甘油在大多数哺乳动物中都有应用。在家禽上，二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、DMA（二甲基乙酰胺）、DMP（NN-二甲酰胺）经常用到。（5）精液一般通过“慢速冷却”法进行冷冻保存，研究发现最优冷却速率大多集中在10～100/min℃的范围内。在一定程度上，报道中的差异可能跟抗冻剂的种类和浓度有关。一个极端的例子就是当鸡的精液用二甲基乙酰胺而不是甘油作抗冻剂时，冷却速率在600/min℃效果最好。细胞膜对不同抗冻剂的通透性变化较大，同时抗冻剂也影响膜对水的通透性。这些参数不仅影响了细胞的脱水速率，也影响最优冷却速率。

1.3卵母细胞过去的十年中，卵母细胞冷冻技术得到了巨大发展。已有许多动物卵母细胞解冻后成熟、受精和胚胎发育成功的报道。在牛、鼠、大鼠、马和人上已有利用冷冻保存的卵母细胞产生胚胎并最终获得成活胎儿的报道，但其效率和可靠性仍远远低于冷冻胚胎。在家禽和鱼上卵母细胞的冷冻保存未获成功。这是由于鸟类和鱼类卵母细胞体积较大，脂类含量较高以及其两极构造（动物极和植物极）。

1.4胚胎或胚胎细胞牛胚胎的冷冻保存非常成功，慢速冷冻和玻璃化方法都很有效。冷冻保存的成功依赖于胚胎所处的时期，如囊胚的冻存效果特别好。在重要家畜种类上已有利用冻存的胚胎获得成活后代的报道。猪胚胎的冷冻保存一直是个难题，这主要是因为猪胚胎的冷敏感性和它较高的脂类含量。近期的研究主要集中在解决这些问题以及寻找能在猪胚胎冷冻保存中成功应用的玻璃化方法上。

1.5体细胞多种类型体细胞的冷冻保存已被实验证明是可行的。早期研究发现，加入5%～10%适宜的抗冻剂如甘油、DMSG到培养基细胞悬液中，将带几毫升悬液的培养管放到-80℃冷冻设备中保存，该方法目前仍然在有效利用。但是用这种简单方法不能控制冷却速率，事实上在很多文章中冷却速率都是不可控的，只有皮肤成纤维细胞等很少的研究中使用了控温冷冻设备。

1.6进展（1）对低温生物学基础领域的更多关注将使冷冻保存方法获得更大发展。一种基础方法已广泛应用于有关哺乳动物精液和胚胎的研究中，但却较少应用于鱼类和鱼类精液研究。最近提出了一种估计适用于“慢速冷却”冷冻方法最优程序的理论模型。这一模型表明非线性冷却图要比线性图的冷却程序效果更好。与其它模型一样，该模型也证明最优冷却速率可与抗冻剂浓度互相影响，这也在实验研究中发现过，因此在最优实验研究中确定这两个因素很重要。改善冷冻方法可提高冷冻的整体水平，即使用较差冷冻设备处理的精子也能够获得足够的解冻后活力。（2）对精子玻璃化的尝试尚未成功。最近表明在没有抗冻剂下利用极高的冷却速度（72000/min）℃，有可能使人的精子玻璃化，只有这种条件下，才能避免由于抗冻剂的存在所造成的损坏、冻伤和冰晶的形成。玻璃化技术的进一步完善对冷敏感细胞的冷冻特别重要：例如克服第二次减数分裂中期卵母细胞纺锤体微管解聚效应。极高的冷却速率可应用于开放式拉长冷冻细管技术，也可通过使用冷冻环加以应用。由于解冻后纺锤体仍能恢复正常的形态和功能，即使在慢速冷冻过程中被打断仍可获得较好的冷冻效果。

2　异位保护策略的影响

（1）保存材料种类的选择和采样策略取决于保护计划的目的。根据材料类型、冷冻保存技术的可行性、成本和实际环境不同，所做的选择也会不同。总的来说，冷冻保存和相关的繁殖技术成本都很昂贵。异位保护广泛发展的主要限制因素是收集成本昂贵，保存的物质应用有限。采样、收集、冷冻、保存和遗传材料利用的成本存在种间差异，最佳的策略取决于当地的环境，技术能力和人工设备成本。Gandini和Pizzi查阅了有关保护成本的文献，并得出了结论：有关异位保护成本的文献有限，也不及时。Labroue计算了在欧洲4个国家建立精液保存库的成本，每个品种大约30000欧元（Euro），单位剂量15欧元。考虑到人工费用、实验费用和基础费用，假定冷冻能力在每天6次射精量上，在荷兰进行猪精液冷冻保存的成本估计为10欧元/剂量。精液由AI中心到贮存处的运费和精液收集的费用未考虑。（2）荷兰遗传资源中心（CGN）的实验表明：不同物种精液收集和冷冻的成本，在单位剂量少于1欧元（牛）到多于20欧元（绵羊和家禽）不等。绵羊和家禽较高的成本是由单位剂量过高的操作，培训和冷冻成本以及缺乏这些物种AI基础设施造成的。CGN得出了实验结论：在绵羊品种遗传多样性保护中，作为射精后精液收集和冷冻的一种备选，收集和冷冻淘汰公羊附睾精液是一种低投入高产出的方法。（3）物种间世代间隔和繁殖率的差异也可能影响保护计划的制定。与其它物种相比，一些物种可以用便宜而简单的方法快速繁殖一代，例如在鱼中用保存的精液通过回交再生一个灭绝的物种是可行的，这是因为鱼类有较短的世代间隔和较高的年周转量，相反，同样的策略应用于牛或马则不仅费时还相当昂贵，在这些物种中胚胎冻存比精液更适合。（4）胚胎收集和冷冻成本要远远高于精液，但利用胚胎再生的成本远远低于利用精液（重复回交）再生的成本。虽然许多保护计划只注重精液冻存，考虑到回交重建一个品种时线粒体DNA的丢失和时间上的滞后，如果仅出于品种保护的目的，那胚胎收集和冻存的作用就被低估了。在这种情况下，即使克隆的效率有相当大的提高，体细胞的冷冻保存也无法替代胚胎冷冻保存。体细胞冻存的前期成本可能很低，但其线粒体DNA却无法保存，并且随后的生殖克隆在效率上无法与胚胎的冻存和移植相比。精液和卵母细胞的贮存在样品采集和冷冻成本上具有成本优势，但是体外受精和卵收集的成本较高。估计用胚胎代替精液和卵母细胞的总体成本仍会偏高。（5）当材料在冷冻/解冻后的存活率升高，妊娠率也增加时，繁殖足够后代所需的基因库遗传材料就会减少，因而基因库材料中采样和冷冻上的成本就会降低。此外，如果遗传上重要公畜精液的耐冻性能显著提高时采样成本就能进一步降低。矛盾的是，冷冻保存的使用会造成遗传多样性的降低，但同时应用于保护计划时又是有利的，例如在荷兰黑白花奶牛中结合使用遗传评定、AI、冷冻精液和最近出现的其它繁殖技术后获得了较高的遗传进展，促进了荷兰黑白花奶牛以地方奶牛品种的成本在世界范围内更大规模地利用，由此也降低了荷兰黑白花奶牛有效（保种）群体的规模。作为一种副效应，有关牛冷冻精液、AI和其它繁殖技术的知识最终对多个畜种的品种保护发挥了重要作用。

3　结论

（1）在以保护品种为目的的异位保护中，胚胎收集和冷冻保存的作用被低估了，应给予更多关注。（2）冷冻保存技术的发展已经并将继续提高保护计划的效率和效能。（3）冷冻保存技术在其它物种上的发展有助于这些技术在欠发达物种上的发展。（4）保护计划的决策者应定期重新考虑目标成本、技术可行性和实用性之间的平衡。

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S813.11文献标识码：A

1007-1733（2016）08-0084-03

泰安市科技发展计划（201420774-20b）

2016-06-07）