多重PCR 技术在猪病检测中的应用

马　锐，黄小波，杨国淋，滑　翔，赵玉佳（四川农业大学动物医学院，猪病研究中心与基因芯片实验室，四川成都611130）



多重PCR 技术在猪病检测中的应用

马锐，黄小波*，杨国淋，滑翔，赵玉佳
（四川农业大学动物医学院，猪病研究中心与基因芯片实验室，四川成都611130）

摘要：多重PCR技术是一种实用的分子诊断技术，该技术能在同一反应体系中同步扩增多个目的片段，具有高效、快捷、敏感、特异等优势，适用于对大量临床样本的快速检测。本文就多重PCR的技术原理、在猪病检测中的技术类型（常规技术、分型技术、创新技术）等进行了叙述。

关键词：多重PCR；猪病；检测；应用

聚合酶链式反应（PCR）是一种体外酶促合成反应，可以大量扩增特定的DNA序列，是常用的分子生物学技术之一，近年来已渗透到生命科学的各个领域。随着PCR技术的广泛研究与应用，由基本的PCR原理衍生出的新技术已不断出现，其中多重PCR技术在病原诊断中具有重大的意义。

1　多重PCR技术的基本原理

多重PCR技术是PCR技术的一种，由Chamberian等在1888年率先报道。该技术具有高度特异性、敏感性、高效快捷、实验成本低、实验进程快等优点，并迅速在人类、动物以及微生物研究方面得到广泛应用。其原理与PCR技术原理基本一致，指在同一反应体系中加入两对或多对特异性引物，同时扩增多个目的基因或DNA序列。在各种生物基因组中存在连续的20～30个相同或者互补碱基的概率几乎不存在，并且DNA聚合酶具有非常高的复制准确活性。所以在多重PCR反应体系中，由各引物交叉结合而造成的非特异性扩增的可能性十分小，保证了多重PCR的特异性。多重PCR不但可同时扩增多条目的片段，节省了试剂和时间，而且减少了污染的机会。理论上只要条件允许，引物对的数量可以不限，目前有扩增8条目的片段的记录。但该技术需要对反应体系和反应条件进行多次优化。

2　多重PCR技术在猪病检测中的应用

2.1多重PCR用于常规猪病诊断

2.1.1病毒常规检测焦洋等［1］根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因序列、猪流行性腹泻病毒（PEDV）M基因和猪博卡病毒（PBoV）NP1基因序列，设计合成3对特异性引物，建立了检测TGEV、PEDV 和PBoV的多重PCR方法，用该方法检测60份临床样品，得出TEGV阳性率为1.6%，PEDV阳性率为6.7%，PBoV阳性率为21.7%。Xu等［2］建立了检测圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、经典猪瘟病毒（CSFV）、蓝耳病病毒（PRRSV）、乙型脑炎病毒（JEV）的多重PCR，该技术可同时鉴别诊断6种常见病毒病，且对各类病毒的灵敏度均高于普通PCR，各引物之间没有交叉反应，特异性高。Ogawa等［3］建立了可检测盖塔病毒（GETV）、TGEV、猪轮状病毒A型（GAR）、PEDV、JEV、PRRSV、PPV、猪水泡病毒1型（SuHV-1）和PCV2的8重PCR检测方法，使用该方法检测75份临床样本，其检测结果与普通PCR的结果相一致，表明该方法具有良好的灵敏性和特异性。

2.1.2细菌常规检测Rossi等［4］基于SCAR片段建立的三重PCR可准确鉴别诊断胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌以及多杀性巴氏杆菌，该方法与普通PCR结果相一致，对临床疾病的诊断和流行病学调查有重要意义。李伟杰等［5］分别针对志贺毒素Stx2eA亚基、大肠埃希菌16S rDNA和菌毛F18ab A亚基的保守序列设计合成3对特异性引物，优化并建立了多重PCR，结果与其他猪常见致病菌均无交叉反应。该方法对猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断及流行病学调查具有一定的应用价值。安俊卿等［6］根据沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌kmt1基因和大肠埃希菌23S rRNA基因设计并合成3对特异性引物，通过优化反应条件建立了多重PCR方法，结果对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×104CFU/mL、1.88×104CFU/mL、2.01×104CFU/mL。该方法特异性强、敏感度高、稳定性好，能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。

2.2多重PCR用于猪病分型鉴别

2.2.1病毒的分型鉴定王晓波等［7］根据GenBank中公布的已知序列对CSFV、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒（C-PRRSV）分别设计特异性引物，优化并建立了多重RT-PCR方法，结果显示可用2对引物同时检测这3种病毒。徐磊等［8］根据猪圆环病毒1型（PCV-1）、圆环病毒2型a（PCV-2a）以及圆环病毒2 型b（PCV-2b）序列的差异设计了3对特异性引物，并通过优化反应条件建立了三重PCR方法，结果表明该方法灵敏性高、引物特异性良好，各引物之间没有出现交叉反应。用此方法对采集自陕西省的56份样品进行检测，其检测结果与单重PCR检测结果的符合率达88%以上。

2.2.2细菌的分型检测Liu Z等［8］利用全基因组高通量测序设计特异性引物，完成了多重PCR的建立，用该方法对链球菌进行鉴别诊断，结果显示：经过4次多重PCR，成功鉴别出了33种血清型。张亮等［10］根据JEV基因I型和基因III型的保守序列设计特异性引物，并对反应体系及条件进行优化，建立了多重RTPCR方法，用该法检测27份临床样品，结果灵敏且特异性地检测出了5份为基因I型，2份为基因III型，与核苷酸序列分析结果一致。

2.3多重PCR与其他技术的创新结合

2.3.1与荧光定量PCR技术结合王乃福等［11］根据口蹄疫病毒（FMDV）3D蛋白编码基因、水疱性口炎病毒（VSV）N蛋白编码基因和猪水泡病病毒（SVDV）VP1蛋白编码基因的高保守区设计了特异性引物和探针，成功建立了可同时检测这三种病毒的多重荧光RT-PCR检测方法。结果经扩增显示，该方法灵敏度高，特异性良好，可实现对多种病毒混合感染的同时检测。Zhao等［12］结合荧光定量PCR技术与多重PCR技术成功地建立了一种快捷高效的荧光定量多重PCR检测方法，用于鉴别猪流行性腹泻病毒（PEDV）的经典株和变异株。该方法针对PEDV保守序列中的S基因设计两套引物，可对不少于5×102DNA拷贝数进行检测。使用该方法检测42份临床腹泻病料，其中36份为变异毒株，3份为经典毒株。

2.3.2与不对称PCR和悬浮阵列技术结合Chen等［13］结合不对称PCR技术、悬浮微阵列技术以及多重PCR技术，成功建立了一种可同时检测PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV、PPV的诊断方法。用该方法检测218份临床病料，检测率均高于RT-PCR和不对称PCR，且从提取病毒核酸到显示检测结果只需2h。

2.3.3与LAMP技术结合Park等针对引起猪增生性肠病的胞内劳森氏菌的不同基因设计了4段引物，将多重PCR与环介导等温扩增技术（LAMP）相结合，所建立的新方法特异性强，灵敏性是RT-PCR的10～100倍，同时节约了试剂成本和检测时间。

2.3.4与基因芯片技术结合王小强等［14］针对PCV-2、PPV、PRV、SIV、CSFV、FMDV和PRRS建立的多重不对称PCR扩增方法与寡核苷酸基因芯片相结合，杂交反应中使用胶体金进行标记，最后用银染试剂进行显色，建立了可同时检测7种常见猪病的可视化寡核苷酸基因芯片，其检测结果与普通PCR检测结果的符合率为100%。基于多重PCR技术的寡核苷酸可视化基因芯片，具有灵敏性高、节约费用和省时等优良特性。

3　多重PCR技术的应用前景

多重PCR技术以其快速、高效、特异性好、灵敏度高的优点在病原检测方面与流行病学调查方面具有重要作用［15］。多重PCR在反应过程中可能存在多对引物之间的相互抑制，引物与非靶序列结合可能产生非特异性扩增，因此在确立多重PCR实验方案时，首先应合理设计引物，同时重视优化反应体系中的主要成分和反应条件，以减少非特异性扩增和假阳性。除此之外，多重PCR作为一种灵敏快速、高通量的特异性扩增技术常常与其他方法结合使用，如在硅玻基片中完成系列核酸扩增反应的多重PCR基因芯片技术、LAMP技术、实时多重PCR技术、巢式多重PCR、荧光定量多重PCR等。但其在实际应用中也存在不少问题，一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果；且反应为多对引物同时扩增，若各种实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或出现假阳性、假阴性等非理想结果。

多重PCR技术在今后病原检测中的研究应用仍需要改善。首先，为增加检测病原数量，可进一步增加反应体系中的引物对，以拓宽一次扩增反应所能检测的范围。同时，未来应重点检测疫苗株和变异株，做流行病学调查，为疾病防治做准备。其次，多重PCR应与其他技术结合，以提高检测敏感性和特异性，缩短检测时间。最后，应对实验室进行严格分区，加强实验室的管理等。

参考文献：

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［2］Xu X G，Chen G D，Huang Y，et al. Development of multiplex PCR for simultaneous detection of six swine DNA and RNA viruses［J］. Journal of Virological Methods，2012，183（1）：68-74.

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［7］王晓波，李丽敏，袁万哲，等.猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性/经典毒株多重RT-PCR方法的建立及应用［J］.中国兽医学报，2015（5）：675-678.

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［8］Liu Z，Zheng H，Gottschalk M，et al. Development of multiplex PCR assays for the identification of the 33 serotypes of streptococcus suis［J］. Plos One，2013，8（8）：65-71.

［10］张亮，刘澣扬，石双艳，等.日本脑炎病毒基因Ⅰ型与III型复合RT-PCR鉴别方法的建立［J］.中国兽医科学，2014（4）：134-140.

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Application of Multiplex PCR in Detection of Swine Disease

MA Rui，HUANG Xiaobo，YANG Guolin，et al.
（Veterinary Medicine College of Sichuan Agricultural University，Swine Diseases Research Center and Gene Microarray Lab，Sichuan Chengdu 611130，China）

Abstract：As a rapid，efficient，high-specificity and sensitivity method to amplified fragments in a single reaction，multiplex PCR technology is suitable for detection and analysis of large numbers of clinical samples. In this article，the fundamental and technological type in swine diseases detection of multiplex PCR （conventional detection，identification technology，creative technology）were described detailedly.

Key words：Multiplex PCR；Swine disease；Detection；Application

中图分类号：S818.8

文献标识码：A

文章编号：1001-8864（2016）05-0031-03

收稿日期：2016-02-25

基金项目：公益性行业（农业）科研专项项目“新型动物疫病诊断技术应用”（201203056）

作者简介：马锐（1888-），男，四川成都人，硕士研究生，主要从事动物传染病研究。E-mail：iwanttogetsci@163.com

*通讯作者：黄小波，教授。E-mail：rsgh110@126.com