Nrf2-Keap1信号通路对肿瘤生物学行为影响的研究进展

韩伦，赵琳

(1抚顺市矿务局总医院，辽宁抚顺 113000；2中国医科大学药理学教研室)



Nrf2-Keap1信号通路对肿瘤生物学行为影响的研究进展

韩伦1，赵琳2

(1抚顺市矿务局总医院，辽宁抚顺 113000；2中国医科大学药理学教研室)

核因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子，Nrf2与其接头蛋白Keap1是细胞抗氧化反应的中枢调节者。当体内发生氧化应激反应时，Nrf2与锚定蛋白Keap1发生解聚，解聚后的Nrf2与抗氧化反应元件(ARE)相互作用，可增加ARE调控的Ⅱ相氧化还原代谢酶活性并上调抗氧化反应基因表达水平，从而增加细胞抵抗氧化应激的能力。近年来相关领域研究结果发现Nrf2-Keap1在恶性肿瘤表达明显增加，Nrf2-Keap1信号通路在肿瘤发生、进展、迁移以及化疗敏感等方面发挥重要作用，现将其研究进展综述如下。

核因子E2相关因子2；锚定蛋白Keap1；信号通路；肿瘤；生物学行为

近年来随着环境污染的加剧、人们饮食结构的改变以及遗传等内在因素的影响，恶性肿瘤的发病率和病死率呈逐年升高趋势。肿瘤相关基因信号通路成为研究热点。前期的研究结果提示，核因子E2相关因子2(Nrf2)及其接头蛋白Keap1是细胞抗氧化反应的中枢调节者，Nrf2-Keap1信号通路在肿瘤发生、进展、迁移以及化疗敏感等方面发挥重要作用[1]。本文就Nrf2-Keap1信号通路基本结构与功能及其对肿瘤的生物学行为、放化疗敏感性影响的研究进展作一综述。

1 Nrf2-Keap1信号通路的基本结构与功能

1.1 Nrf2的基本结构与功能 Nrf2分子量为66～68 kD，机体各种组织细胞中均可见Nrf2表达。Nrf2蛋白质结构中包含1个基本的亮氨酸结构域，在人体表达中，Nrf2基因包含重要的6个活性功能区域，Neh1～6。Neh1功能区包含1个可与小Maf蛋白形成异二聚体的拉链结构bZIP，bZIP与Maf形成的异二聚体帮助Nrf2识别抗氧化反应元件(ARE)上特定DNA序列并与之结合，继而达到上调下游目的靶基因转录水平目的。Neh2功能区与细胞质锚定蛋白Keap1相结合，Neh2上的ETGE缺失或突变会解除Nrf2和Keap1相互作用[1]。研究发现，当小鼠被敲除Nrf2基因后，多种基因(如环氧化水解酶、GCL、GSTs、HO-1、醌氧化还原)的表达水平都会降低，而上述基因能清除体内氧自由基、生物毒性以及致癌物等，消除此类毒性物质可减少核酸及生物活性蛋白质的破坏，维持机体内环境稳态。之前的研究结果显示，Nrf2作为转录因子在抵抗细胞对抗外来异物和减轻氧化损伤中发挥重要作用[2]。Nrf2表达水平下降或缺失，会导致细胞对应激源敏感性升高；而细胞敏感性升高与癌症进展、细胞凋亡以及炎症修复时间延长等病理过程密切相关。

1.2 Nrf2的转录活化 Nrf2蛋白Neh4和Neh5功能区的第494位、511位及545和554位之间的氨基酸残基具有细胞核信号传递和双向核转位调节功能。Neh4功能区包含一个转录连接器基序结合序列，可调节转录[3]。Neh5功能区与p45NF-E2结构上高度相似，可与CREB结合蛋白(CBP)相互作用。在所有家族成员中，Nrf2对目的基因的转录调节功能最强，可将靶基因转录活性提高100倍左右，其强效上调转录能力可能与Neh4-CBP和Neh5-CBP的协同作用相关[4]。Zhang等[5]研究发现，Nrf2结构与生物学活性的稳态，与Keap1参与Nrf2泛素化作用相关，C273及C288两个半胱氨酸位点在泛素化过程中发挥关键作用。

降解决定子(degrons结构)通常由氨基酸序列和(或)一个特别的蛋白质构象结合而成，降解决定子参与泛素化依赖蛋白酶介导的蛋白降解过程的关键反应步骤：E3泛素化连接酶必须先对降解决定子识别并结合相互作用。Nrf2的降解决定子是位于Neh2区的丝氨酸残基，正常生理状态下，Neh2区的降解决定子与E3泛素化连接酶复合物Keapl结合，呈非活化的降解状态。氧化应激发生时，降解决定子因磷酸化而发生构象改变，泛素化依赖蛋白酶对Nrf2的识别能力减弱，结合及复合物形成减少，Nrf2降解减少，其转录调节活性相应增强。Nrf2泛素化调节机制与P53稳定机制相似。正常生理状态下，P53与Mdm2蛋白-E3连接酶结合成为泛素化依赖的降解蛋白酶作用的目标底物，表达水平降低，呈非活化状态。应激反应及核酸损伤修复过程中，P53蛋白Ser-20位点发生磷酸化，P53与Mdm2的相互作用减弱，从而P53降解减少，稳定性及生物学活性升高。以往研究表明，蛋白激酶C(PKC)家族中的众多成员可使Nrf2发生磷酸化，作用位点在Nrf2的Ser-40[6]。

1.3 Keap1的基本结构与功能 Keap1是相对分子量为69 kD的蛋白质，Keap1蛋白质与果蝇肌动蛋白Kelch在结构上具有相似性而得名。Keap1蛋白DGR功能区包含6个双甘氨酸重复序列，DGR功能区负责结合Nrf2以及胞质内肌动蛋白，进而发挥生物学功能[7]。生理条件下，Nrf2被Keap1局限在胞质中，外源氧化剂或亲电试剂或氧化剂影响下，Nrf2与Keap1发生解偶联，Nrf2转移进入细胞核，结合Maf蛋白成异二聚体。Nrf2-Maf异二聚体协助识别并结合ARE，进而激活目标代谢酶并上调抗氧化应激基因转录水平，实现细胞抗氧化应激反应。氧化还原平衡后，Keap1穿梭至细胞核内，将Nrf2协同转运回到细胞质后降解Nrf2，此循环实现Nrf2-Keap1信号传导通路[8]。

1.4 Nrf2-Keap1信号通路的调节机制 氧化应激反应的诱因有很多，主要包括外源性药物、重金属、氧化剂以及电离辐射等理化因素[9]。氧化应激反应产物活性氧和亲核物质可诱发机体急、慢性炎症、动脉粥样硬化、神经系统病变、甚至恶性肿瘤等疾病。生理条件下，Nrf2与Keap1的结合定位于细胞质中，被活性氧和亲核物质激活后，通过细胞外信号途径，主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)、PKC以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，致使Nrf2磷酸化而活化。Nrf2从Keap1中解离，进入细胞核内，激活后的Nrf2进而达到基因转录调节的功能。Kobayashi等[10]研究发现，Keap1的IVR区可与CuB结合，成为E3泛素化连接酶复合物的一部分；同时Keap1本身就具备泛素化连接酶生理活性。生理状态下，Keapl与Nrf2结合，局限表达于细胞质，Nrf2处于非游离及不断降解的非活性状态。Keapl蛋白C273和C288半胱氨酸位点被认为是结合Nrf2并限定其活性的分子基础。C273和C288这两个位点中任何一个发生突变，针对Nrf2蛋白质的泛素化作用即会消除。外源氧化反应诱导因子可作用于C273、C288位点，引发Keapl构象改变。与Nrf2的耦联作用力减弱，对Nrf2的泛素化作用消除，故细胞裂解液中可见Nrf2含量增加、半衰期明显延长。

1.5 Nrf2-Keap1信号通路与抗氧化系统 机体氧化应激反应诱发的异常蛋白质的聚集，可导致神经退行性改变以及细胞损伤，目前研究证实Nrf2-Keap1信号通路在细胞抵御外源性或内源性氧化应激的机制中的重要地位。Kwak等[11]发现编码蛋白酶亚单位的基因是Nrf2-Keap1信号通路的下游靶基因，应用一种植物源性抗氧化剂处理肝脏组织，实验结果显示，处理后肝脏组织中抗氧化相关蛋白酶活性升高，而对照组Nrf2缺失小鼠无此现象，这一实验结果可成为Nrf2参与蛋白酶亚单位基因调控的又一有力证据。这一结果初步揭示，Nrf2介导细胞抵抗氧化应激的作用机制主要是调控蛋白酶亚单位基因表达水平，活化蛋白酶，降解氧化应激引起的异常蛋白[12]。

2 Nrf2-Keap1信号通路对肿瘤生物学行为的影响

2.1 Nrf2-Keap1信号通路与肿瘤的发生 目前的研究已证明，多种恶性肿瘤发生、发展过程中可见Nrf2基因表达水平的下降或无表达，是肿瘤易感性的一个重要的因素[13]。Nrf2蛋白对防止异源性破坏DNA而致癌发挥着重要的保护机制。Nrf2功能的诱导剂可作为阻断剂，阻止致癌因子与靶目标基因相互作用，抑制致癌物的产生及活化，防止致癌因子与重要的生物大分子如核酸和蛋白质等相互作用。甲基汞这一公认的致癌物质可激活Nrf2，Nrf2的激活可以促进甲基汞进入细胞间隙排泄并降解。Morito等[14]的研究也发现，敲除Nrf2基因的小鼠血液中亚硝基胺浓度明显增高，增加了小鼠发生恶性肿瘤的风险。Keap1-Nrf2调控系统中，Keap1对Nrf2的抑制对氧化还原Ⅱ相代谢酶的调节具有很重要的作用，氧化还原Ⅱ相代谢酶可以通过结合反应来减少过氧化物对机体的损害。敲除Keap1的小鼠，其血液内的氧化还原Ⅱ相代谢酶含量明显增高，大部分小鼠在出生3周后死亡，大部分小鼠死于食管和胃的过度角化。在同时敲除Nrf2基因的情况下，可逆转Keap1敲除后所引起的发育缺陷出现，表明Keap1负性调控Nrf2是机体必须的。

2.2 Nrf2-Keap1信号通路与恶性肿瘤耐药性 Yomamoto等[15]研究者最早发现Nrf2-Keap1信号通路在维持细胞氧化还原平衡，防御外源性有害物及致癌物过程中发挥重要作用。但近来研究发现，Nrf2可通过降低肿瘤细胞化疗敏感性起到肿瘤细胞保护作用，比如诱导耐药的产生该信号通路的下游基因，如HMOX-1、GPx及Prx1等都与肿瘤细胞泵出药物有关。该信号通路参与多药耐药蛋白(MRPI-2)的调节，而MRPI-2与多种恶性肿瘤的多药耐药性直接相关。此外，Nrf2还可与HO-1相互作用，引起细胞耐药。目前Nrf2-Keap1信号通路在肿瘤耐药中作用机制尚处于起步阶段，但已有实验证实，下调Nrf2表达后可提高多种恶性肿瘤细胞如乳腺癌细胞、结直肠癌细胞及肺癌细胞对相应化疗药物的敏感性[16]。在进一步的研究中检测Nrf2下游相关蛋白的表达变化可为临床诊疗提供新的药敏及肿瘤标记物，为肿瘤药物的耐药逆转剂的研发提供有力的理论基础，提高肿瘤的化疗敏感性，改善恶性肿瘤的预后。

2.3 Nrf2-Keap1信号通路与恶性肿瘤的预防 植物来源的强Nrf2的诱导剂包括莱菔硫烷、姜黄素、表儿茶素酯、白藜芦醇、咖啡酸苯乙醋、咖啡醇和咖啡白、番茄红素；一些合成的化学药品如奥替普拉、CDDO及其衍生物CDDO-Im也是强Nrf2诱导剂。这些化学预防复合物发挥作用的机制涉及诱导Nrf2依赖的适应性，调节氧化还原Ⅱ相代谢酶水平、抗氧化和防止细胞随后发展成肿瘤的运载体等[17]。

2.4 Nrf2-Keap1信号通路对肿瘤的保护作用 Nrf2-Keap1信号通路可同时保护正常细胞和肿瘤细胞免于氧化应激的破坏。多种肿瘤细胞系或组织标本中可检测到Keap1基因突变或Keap1基因表达水平的异常下调，Keap1突变及表达异常可保护肿瘤细胞，促进其增殖进展，作用机制可能是Nrf2蛋白表达水平升高及其下游基因的转录激活。肺癌研究中可见肺腺癌患者的Keap1体细胞突变率增高，不能有效控制Nrf2的功能。Keap1功能缺失会导致Nrf2过度表达，促进恶性肿瘤生长[18]。

综上所述，在未来肿瘤的个体化治疗中，抑制Nrf2的活性与表达将成为极具潜力的治疗方法。

[1] Takagi Y, Kobayashi M, Li L, et al. MafT, a new member of small Maf protein family in zebra fish[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,320(1):62-69.

[2] JinW, WangH, YanW, et al. Role of Nrf Zin Protection against traumat in brain injury in mice[J]. J Neurotrauma, 2009,26(l):131-139.

[3] Klaassen CD, Reisman SA. Nrf2 the resue: effects of the antioxidative/eletrophilic response on the liver[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2010,244(1):57-65.

[4] Maher J, Yamamoto M. The rise of antioxidant signaling-the evolution and hormetic actions of Nrf2[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2010,244(1)：4-15.

[5] Zhang DD, Hannink M. Distinct cysteine residues in Keapl are required for Keap1. dependent ubiquitination of Nrf2 and for stabi-hzation of nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress[J]. Mol Cell Biol, 2003,23(22)：8137-5151.

[6] Reddy NM, Qureshi W, Potteti H, et al. Regulation of mitochondrial functions by transcription factor NRF2[M]. New York：Springer, 2014: 27-50.

[7] Huang CS, Lii CK, Lin AH, et al. Protection by chrysin, apigenin, and luteolin against oxidative stress is mediated by the Nrf2-dependent up-regulation of heme oxygenase 1 and glutamate cysteine ligase in rat primary hepatocytes[J]. Archives of Toxicology, 2013, 87(1):167-178.

[8] Jaiswal AK, Kaspar JVV, Nitum SK. Nrf2：INrf2(Keap1)signaling in oxidative stress[J]. Free Radic Biol Med, 2009, 47(9):1304-1309.

[9] Tong KI, Katoh Y, Kusunoki H, et al. Keap 1 recruits Neh2 through binding to ETGE and DLG motifs: characterization of the two site molecular recognition model[J]. Mol Cell Biol, 2006,26(8):2887-2900.

[10] Kobayashi A, Okawa MI, Okawa H, et al. Oxidative stress sensor Keap1 functions as an adaptor for Cul3-based E3 ligase to regulate proteasomal degradation of Nrf2[J]. Mol Cell Biol, 2004,24(16):7130-7139.

[11] Kwak MK, Wakabayashi N. Greenlaw JL, et al. Antioxidants enhance mammalian proteasome expression through the Keap1-Nrf2 signaling pathway[J]. Mol Cell Biol, 2003,23(23):8786-8794.

[12] Singh A, Misra V, Thimmulappa RK, et al. Dysfunetional KEAP1-NRF2 interaction in non-small-cell lung caneer[J]. PLoS Med, 2006,3(10):e420.

[13] Zhang P, Singh A, Yegnasubramanian S, et al. Loss of Kelch-like ECH-associated protein 1 function in prostate cancer cells causes chemoresistance and radioresistance and promotes tumor growth[J]. Mol Cancer Ther, 2010,9(2):336-346.

[14] Morito N, Yoh K, Ltoh K, et al. Nrf2 regulates the sensitivity of death receptor signals by affecting intracellular glutathione levels[J]. Oneogene, 2003,22(58):9275-9281.

[15] Yamamoto M, Koyama A. EPR imaging of reducing activityin Nrt2 transcriptional factor-deficient mice[J]. Free Radie Biol Med, 2003,34(10):1236-1242.

[16] Kweon MH, Adhami VM, Lee JS, et al. Constitutive overexpression of Nrf2-dependent heme oxygenase-1 in A549 cells contributes to resistance to apoptosis induced by epigallocatechin 3 -gallate[J]. J Biol Chem, 2006,281(44):33761-33772.

[17] Takahashi T, Sonobe M, Menju T, et al. Mutations in Keap1 are a potential prognostic factor in resected nonsmall cell lung cancer[J]. J Surg Oncol, 2010,101(6):500550.

[18] Konig J, Hartel M, Nies AT, et al. Expression and localization of human multidrug resistance protein (ABCC) family members in pancreatic carcinoma[J]. Int J Cancer, 2005,115(3):359-367.

辽宁省高等学校优秀人才支持计划(LJ2015118Q)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.037

R73

A

1002-266X(2016)36-0103-03

2016-04-01)