血清S100B蛋白的检测方法综述

刘仲仲　段康丽综述，吴松笛审校

（西安市第一医院神经内科，陕西西安710002）

·综述·

血清S100B蛋白的检测方法综述

刘仲仲段康丽综述，吴松笛审校

（西安市第一医院神经内科，陕西西安710002）

S100B蛋白是一种小分子钙结合蛋白，约96%表达于脑内胶质细胞中。血清中S100B蛋白浓度较低，但在一些脑损伤所导致的病理状态下则可透过血脑屏障而急性升高，并且其升高的程度与神经系统疾病的病情及预后具有密切关系，被认为是脑的特异性蛋白。因此，准确、方便且快捷的S100B检测方法对临床和科研工作尤为重要。本文根据近年来的相关文献，对S100B蛋白现有的检测方法及对比研究进行综述。

S100B蛋白；检测方法

1　生物学特性

1965年Moore等［1］首次在牛脑组织中分离发现了S100蛋白，因其在中性饱和硫酸铵溶液中100%溶解而命名。随后的研究发现，S100蛋白是一类具特殊EF-hand型结构的相对分子量较小的酸性钙结合蛋白，该家族现有24个成员 （包括S100A1-S100A16、S100B、S100P、S100Z等），广泛分布于不同组织［2-4］。多数S100蛋白以二聚体的形成存在，也能形成三聚体、四聚体等，主要依赖疏水作用力聚合，人的S100蛋白编码基因主要定位在染色体lq21上。

S100B蛋白（以前曾称为S100β蛋白）是由两个β亚单位通过半胱氨酸残基形成的二硫键组成，是S100家族中在脑内主要的和最具有活性的成员。约96%的S100B蛋白存在于脑内胶质细胞中，因此也被认为是脑的特异性蛋白。S100B蛋白有广泛的生物学活性，生理浓度下发挥多种重要的生理学功能，包括影响神经胶质细胞的生长、繁殖和分化，维持钙稳态，并可能对学习记忆等发挥一定的作用等［2，5］。正常人血清S100B蛋白含量＜0.2μg/L，通常难于测定。脑损伤时造成神经胶质细胞膜受损，S100B蛋白释放至细胞外间隙，并通过受损血脑屏障进入脑脊液和血液［6］。S100B蛋白表达过量时，具有神经毒作用，使神经系统炎症恶化加速，导致神经系统功能紊乱，影响钙自动调节动态平衡，导致细胞死亡［2，5］。

随着对S100B蛋白研究的深入，其血清中的含量与一些神经系统等疾病的病情及预后关系密切［7，8］。因此，在目前的临床和科研领域，对于S100B蛋白准确、方便且快捷的检测方法尤为重要。

2　S100B血清学检测方法

随着方法学的不断发展，在S100B的检测方法上也有了明显的改善，当前，S100B的检测方法主要有：放射免疫分析法（RIA）、免疫放射测定法（IRMA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、电化学发光法（ECLIA）以及电化学检测法（Electrochemical assay）和磁珠量子点检测法（MB-QD）等［9，10］。方法总结如下：

2.1放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）放射免疫分析法（RIA）又称竞争性饱和分析法，是利用同位素标记与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。该法的检测极限可达到ng～pg级，组内和组间变异系数分别约为5%和10%。Gazzolo D等［11］利用RIA法检测胎儿宫内发育迟缓（IUGR）症状的孕妇脐带血样中S100B的含量变化，并与正常组比较，发现IUGR脐带血中S100B蛋白的含量明显高于正常对照组，预示围产期胎儿脑细胞可能受到损伤。虽然该方法已成为一些基础学科和临床医学进行实验和诊断的重要检验手段。然而，经长期的临床和实践检测以及非放免分析法的不断发展，发现该方法存在以下不足：⑴该方法只能检测具有免疫反应性的物质，对于失去免疫反应性的物质则无法检测。⑵实验条件要求严格，生物试剂的稳定性受多种因素影响。⑶由于被测物和标准物都不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量。⑷该法存在放射线辐射和污染等问题。目前在检测中已较少使用。

2.2免疫放射测定法 （Immunoradiometric assay，IRMA）又被称为“非竞争性RIA”，为了与放射免疫分析法区分，故称为免疫放射测定法（IRMA）。是采用过量的标记抗体去结合所有抗原，经吸附除去游离的标记抗体，测定反应中剩余的放射性强度，可以反映出待测抗原的量。Nygaard O等［12］应用IRMA原理，检测血清或脑脊液中S100B含量，其灵敏度为0.13μg/L，高值和低值CV分别为5%和10%。Heizmann CW［13］等采用IRMA实验研究发现该法检测S100B的特异性很强，线性范围为0～20μg/L，用来检测人体体液中S100B结果是明确且可靠的。相比于放射免疫分析法（RIA），虽然免疫放射法IRMA具有一定的优势，但也存在以下缺点：⑴由于放射性同位素有衰变的因素，就使得每次试验时，标记抗原或抗体必须同时作标准曲线，这样在短时间内发出报告就比较困难；⑵由于放射性同位素不可避免地污染环境，使用过程中要具有一定的防护设施。使得该方法也渐渐淡出血清中S100B蛋白含量的检测。

2.3酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。目前，国内外对于ELISA方法的研究较多。在国外，意大利索灵集团（DiaSorin）、美国亚诺法（Abnova）、美国Fujirebio Diagnostics公司和其子公司CanAg Diagnostics以及欧洲捷克公司BioVendor等生产的血清S100B ELISA检测较为常用。Dia-Sorin S100 ELISA检测试剂盒，其检测标准范围为0～5μg/ml，检测极限为0.03μg/ml，批内及批间平均CV分别为3.7%和5.9%。Abnova生产的ELISA检测试剂盒，其检测参考值范围是0.05～2ng/ml，最小检测值15pg/ml，批内及批间平均差异分别为3.8% 和7.7%。康乃格诊断 CanAg S100A1B EIA和CanAg S100BB EIA是到目前为止分别仅用于特异性分析 S100A1B （主要检测 A1二聚体）和S100BB，检测范围0.01～3.5μg/L，检测极限0.01μg/ L，所需样本体积为50μl，批内CV＜2.5%，批间CV＜2.5%。Nylen K等［14］人利用三种不同的ELISA方法 （Fujirebio Diagnostics AB，Goteborg，Sweden）研究了S100B，S100A1B，S100BB分别在严重创伤性脑损伤的相关性，结果显示：单独分析S100A1B或者S100BB与单独分析S100B相比并没有优势，说明分析S100B蛋白浓度在疾病的结果预测和后期的预后更具优势。此外，在急性颅内出血患者和糖尿病外围神经病变患者血清中S100B的检测用到BioVendor生产的ELISA试剂盒［15，16］，该方法的标准检测范围为10～320pg/ml，批内CV=2.0%，批间CV=5.9%，检测样本所需体积为25μl/孔。在国内，第四军医大学生理学教研室建立了检测S100B蛋白的双抗体夹心ELISA［17］。但此检测体系中抗S100β mAb可与S100β链起反应即与S100A和S100B均可起反应，故不能区分此两种蛋白。因此，检出的S100蛋白应为S100A和S100B的混合物，这是此检测体系的不足之处。另外，福州总医院全军医学检验中心也建立了检测S100B蛋白的双抗体夹心ELISA法［18］。该法线性范围广，灵敏度高，重复性好。血清浓度参考范围为0.068～0.728μg/L。

总之，ELISA法的优点是：线性范围广，灵敏度高，重复性好，操作方便，实验可靠。比较适合用于临床对于患者疾病的检测以及预后的判断，是目前主流的检测方法之一。

2.4电化学发光法 （Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。该方法是利用链霉亲和素包被的磁珠和生物素化的抗体与S100B抗体连接为一体，形成双抗体夹心，最后通过与抗体偶联的发光剂和电子供体TPA通过氧化还原反应在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与发光剂的浓度呈线性关系，故可测出待测抗原的含量。目前，本法对S100B进行检测主要采用德国罗氏诊断公司ElecsysS100（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）和意大利索灵公司提供的全自动分析仪 Liaison Sangtec100（Dia-Sorin S.P.A.，Saluggia，VC，Italy）及其配套的S100B检测试剂。Elecsys仪器根据检测模块的不同有三种型号：Elecsys 1010，2010和E170，检测的持续时间在20min左右，温度控制37℃，检测范围为0.005～2.13μg/L，批间和批内CV＜3%。LiaisionSangtec 100是一种基于化学发光的全自动的免疫检测法，批内CV＜6%，批间CV＜10%。检测范围为0.02～30μg/L［19］。通过对比Elecsys 1010，2010和E170三种型号，在反应时间、样品要求以及试剂的体积等上没有明显区别［20］。Yoon SM等［21］利用Elecsys S100 E170模块系统分析在蛛网膜下腔出血（SAH）和颅内出血（ICH）这两种疾病血清中S100蛋白的含量，显示出该方法检测范围在0.005～39μg/L，批内的协同变异系数为 0.7%～1.8%。得出结论：在ICH的病人中血清中S100B的含量认为是一种独立的病情预后信号，相比之下在SAH疾病中预后不明显。罗氏诊断Elecsys 2010法在不同分娩模式，急、慢性脑损伤以及急性眩晕等疾病［22-24］的检测上也已经得到广泛应用。

电化学发光法的优点：⑴标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定；⑵敏感度高，可达pg/ml水平；⑶线性范围宽；⑷反应时间短，20min以内可完成测定；⑸试剂稳定性好，2～5℃可保持一年以上。总之，ECLIA是目前较为常用的检测方法。

与ELISA法相比其主要优势为其反应动力学较ELISA方法更快，并且具有更大的固相结合表面。分析方法的设计与ELISA方法有很多相似处，但在实验设计上却拥有更多的灵活性。该法唯一的不足就是需基于配套的大型仪器来进行检测，该仪器以及电极的更换价格较贵，导致检测费用较高，限制了其在基层医院的开展。

2.5近年S100B检测的新方法

2.5.1电化学检测法（Electrochemical assay）近年由南京医科大学第一附属医院与南京大学生物化学和医药生物技术国家重点实验室合作建立了一种新的S100B的电化学检测法［9］。该法是一种不同于传统利用抗体、抗原相互作用，该法利用肽作为抗体的简化而且等效的替代品，电化学代替光谱学被用于样品检测的一种新方法。检测极限可达0.1nM，回收率为98.5%～103.7%之间。由于多肽和其他人工合成的配体在蛋白的电化学检测中的应用已经越来越被人们重视［25，26］，使得该方法也存在自己的优势：多肽代替抗体，可以被合成想要的结构，并可进一步修改后用于检测蛋白的目标配体［27，28］。

2.5.2磁珠量子点检测法（Magnetic bead-quantum dot，MB-QD）磁珠（Magnetic bead，MBs）是一种广泛用于生物医学的应用，生物功能化的磁珠常常被用于细胞的分选，生物分离，靶向给药，免疫测定［29，30］。对于较低浓度的样品浓度具有很好的捕获功能。量子点（Quantum dot，QDs）是一种无机的半导体纳米粒子，具有广泛的吸收光谱，很窄的发射峰，可抵抗光致漂白和高的量子产率等独特的光学性质。

Kim C等［10］利用表面功能化的量子点与磁珠偶联后被用于标记捕获物，通过抗体与分析物的结合绑定信号转导探针，从而进行定量的分析。通过这两种技术的结合研究者建立了一种新的磁珠量子点检测法（MB-QD），该方法检测血清中S100B含量具有以下特点：⑴高度特异性的检测；⑵磁珠的使用可使得实验快速，样品的混合和洗涤步骤简单，缩短实验时间在1h以内；⑶可迅速偶联G蛋白和抗体到QDs，从而确保抗体的稳定性与功能性而不需要其他化学试剂和纯化步骤；⑷该方法可检测的临界值范围可从10pg/ml～10ng/ml；⑸从MBs复合物上释放QDs可避免磁珠自体荧光的局限性和磁珠的光散射，从而提高实验的敏感性。

由于这两种是近年新建立的S100B检测方法，虽有明显的优势，但还缺少更多的临床检测研究以及更多文献的支持和引用，因此还较少有人沿用。

3　常用S100B检测方法在临床应用中的比较

S100B蛋白越来越受到医学界的关注，该蛋白的检测方法也得到迅速发展，一些学者对不同厂家的血清S100B蛋白检测方法进行了对比研究。

Hallén M 等对比了 Liaison Sangtec100 （DiaSorin S.P.A.，Saluggia，VC，Italy）和ElecsysS100 （Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）方法在血清与尿中检测 S100B的差异。其中，Liaison Sangtec100对于血清S100B的检测范围为0.02～2.28μg/L，而ElecsysS100检测系统的检测范围为0.005～2.13μg/L，二者在检测范围上存在相关性，相关系数是0.8，两者均差为0.122μg/L，标准偏差为0.069μg/L；这两种方法在检测尿液中S100B时，Liaison Sangtec100检出率仅为 11.5%，而ElecsysS100检出率为98.3%，二者无明显相关性，相关系数为0.6［31］。根据这项研究，在临床应用中，德国罗氏公司ElecsysS100检测系统更方便、精确，但对于脑损伤的病人，这两种方法在检测尿液和血清中S100B时各有利弊，两种方法不可互换。

Smit LH等［32］通过选取155例黑色素瘤患者和98例健康对照组，比较了现阶段的4种方法，包含两种全自动法（Liaison Sangtec100和ElecsysS100）和两种手动方法（Sangtec 100 ELISA和CanAg S100 EIA）在临床上的参考值和相关性。结果显示：两种手动法的功能灵敏度为0.15μg/L。各方法相关系数为0.9，但斜率范围在0.29～3.36。各方法的线性分析除了Sangtec100 ELISA，其他都是可以接受的。各方法对于黑色素瘤疾病的的总体敏感性从37%（ElecsysS100）到47%（Liaison Sangtec100），并随着疾病的阶段性进展而升高，全自动检测系统较手动的更为敏感。

2011年Erickson JA等［33］就恶性黑色素瘤和颅脑外伤后的预后结果对三种商业化的S100B ELISAs检测方法：CanAgS100 EIA（Fujirebio Diagnostics，AB.，Gothenburg，Sweden），Sangtec100 ELISA（DiaSorin，Inc.，Stillwater，MN），YK150Human S-100B ELISA（Yanaihara Institute，Inc.，Shizuoka，Japan）进行比较分析。得出：Sangtec100 ELISA和CanAgS100B ELISAs方法的配置、程序和性能特征相似，都比YK150的更可信赖。

4　展望

总之，现阶段对于血清S100B的检测方法包括：放射免疫分析法 （RIA）、免疫放射测定法（IRMA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、电化学发光法（ECLIA）、电化学检测法（Electrochemical assay）以及磁珠量子点法（MB-QD）。因为荧光免疫测定法价格较高，不易在基层医院普及，RIA与IRMA由于具有放射性，核素半衰期和试剂盒稳定期短，操作繁琐，使之在临床中应用受到限制。目前临床上主要采用的是ELISA和ECLIA法，新建立的电化学检测法（Electrochemical assay）和磁珠量子点检测法（MB-QD）还缺乏广泛的临床应用，后续有望得到更多关注。

相信随着对S100B蛋白检测方法学的不断改进，更准确、更快速、更方便的检测方法将会出现，如床旁的快速检测试纸条等。血清S100B蛋白的检测将会成为一种有效的工具，有助于临床医师对多种神经系统疾病所致脑损伤进行早期诊断、病情进展评估及预后判断。

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R446.61

A

1674-1129（2016）04-0461-05

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.016

陕西省社发攻关项目（项目编号2012K15-02-02），陕西省自然科学基础研究计划项目（项目编号2013JC2-10）。

刘仲仲，男，1984年10月出生，硕士研究生，专业：微生物学，病原菌，致病机制。

吴松笛，男，1972年11月出生，主任医师，主要研究方向：脑损伤蛋白的临床与基础；Email：wusongdi@gmail.com。

（2016-03-04；

2016-04-12）