大孔吸附树脂富集纯化桃儿七中的鬼臼毒素

王谨慧， 靳子明， 李茂星

（1.甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州730020；2.兰州军区兰州总医院药剂科，全军高原环境损伤防治重点实验室，甘肃兰州730050）



大孔吸附树脂富集纯化桃儿七中的鬼臼毒素

王谨慧1， 靳子明1， 李茂星2*

（1.甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州730020；2.兰州军区兰州总医院药剂科，全军高原环境损伤防治重点实验室，甘肃兰州730050）

摘要：目的 建立桃儿七中鬼臼毒素的大孔吸附树脂富集纯化工艺。方法 HPLC法测定样品中鬼臼毒素的含有量，比较12种不同厂家、型号的大孔树脂对桃儿七水提取物中鬼臼毒素的吸附与解吸附条件，优选最佳的纯化工艺。结果 HPD-100型大孔吸附树脂对桃儿七水提取物中鬼臼毒素具有良好的吸附能力，30％乙醇能大量洗脱除去杂质，60％乙醇能解吸附鬼臼毒素，95％乙醇能再生大孔吸附树脂柱。富集后，鬼臼毒素的含有量达到28.46％，远高于水提取物中的1.58％。结论 采用HPD-100型大孔吸附树脂能从桃儿七水提取物中快速富集提取鬼臼毒素，而且树脂重复利用度高。

关键词：桃儿七；鬼臼毒素；大孔吸附树脂；富集纯化

鬼臼毒素（Podophy11otoxin）及其衍生物鬼臼乙叉苷（Etoposide，VP-16）和鬼臼噻吩苷（Teniposide，VM-26）具有良好的抗癌活性，临床广泛用于治疗淋巴瘤、急性白血病、睾丸癌、小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌和脑癌等［1-2］。鬼臼毒素主要来源于小檗科桃儿七属植物桃儿七Sinopodophyllum hexandrum（Roy1e）Ying的果实、根及根状茎［3］，随着鬼臼毒素需求量的增加，对其提取和合成等研究显得尤为重要。目前，对鬼臼毒素的提取主要有化学提取法和柱层析法［4-5］，但都存在化学试剂大量浪费、安全性差、效率低和污染严重等问题。

大孔吸附树脂具有吸附性能好、吸附效率高、再生简单、解吸方便等优点［6］，已经用于植物中黄酮［7］、皂苷［8］、二萜［9］、生物碱［10］等活性单体的分离纯化，但应用其分离纯化木脂素类成分，特别是鬼臼毒素（化学结构见图1）的研究报道较少。本实验通过选用大孔吸附树脂，从桃儿七中分离纯化鬼臼毒素，在有效成分损失较小的情况下很好地除去了杂质，降低了生产成本，提高了产率和质量，并具有简单、无毒和环境友好等特点。

图1　鬼臼毒素（Podophyllotoxin）的化学结构

1 仪器与材料

Waters高效液相色谱仪，包括600型二元控制系统、996型二极管阵列紫外检测器（美国Waters公司）；BP210S电子天平（德国Sartorius公司）；LSA40、LSA5B型大孔吸附树脂（西安蓝晓科技有限公司）；DA201、D101、DM301、AB8型大孔吸附树脂（天津海光化工有限公司）；YWD03F4、YWD09D、YWD07D型大孔吸附树脂（沧州远威化工有限公司）；HPD100、HPD400、HPD600型大孔吸附树脂（沧州宝恩化工有限公司）。桃儿七药材为市售，经兰州大学药学院马志刚教授鉴定为桃儿七Sinopodophyllum hexandrum（Roy1e）Ying。鬼臼毒素（Podophy11otoxin）对照品由兰州大学化学化工学院田暄教授馈赠。

2 方法与结果

2.1 桃儿七水提物的制备 取桃儿七根及根状茎250 g，粉碎至20目，加入蒸馏水1 500 mL，煎煮3次，每次1 h，合并煎煮液，放冷，过滤，即得。

2.2 鬼臼毒素含有量的测定［11-14］采用Waters高效液相色谱仪分析；流动相为45％甲醇；体积流量为1.0 mL/min；检测波长为292 nm；数据采用Mi11enium 2.10版软件处理；Symmetry反向C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；鬼臼毒素标准品为对照。

2.3 静态吸附测定 取12种已处理好的树脂，每种5 mL，加入250 mL小口瓶中，每瓶加入样品液80 mL和蒸馏水20 mL，25℃下静置18 h，期间振摇10次。HPLC法测定各大孔吸附树脂对鬼臼毒素的吸附量。将吸收度数值代入回归方程，求得剩余含有量，重复3次。每mL树脂静态吸附比=被树脂吸附的鬼臼毒素量/5 mL树脂，结果见表1。

表1　12种大孔吸附树脂静、动态吸附量的考察

2.4 动态吸附测定 取12种已处理好的树脂，每种2 mL，加入玻璃层析柱中，20 mL样品液以3 mL/min的体积流量反复上样3次，100 mL蒸馏水洗脱，收集洗脱液。HPLC法测定其中鬼臼毒素的含有量，即为未被树脂吸附的鬼臼毒素量，重复3次。被树脂吸附的鬼臼毒素量=上样总鬼臼毒素量-未被树脂吸附的鬼臼毒素量；每mL树脂动态吸附比=被树脂吸附的鬼臼毒素量/5 mL树脂，结果见表1。

由表可知，各型号大孔吸附树脂对桃儿七水提物中的鬼臼毒素成分都有不同程度的吸附，其中HPD-100型的动态吸附性能最好，LSA-40最差，但差距不大。

2.5 HPD100洗脱体系研究

2.5.1 洗脱溶剂的选择 考虑到在富集纯化过程中，动态吸附能力更加重要，因此根据上述实验，选取HPD-100型树脂继续研究。取已处理好的HPD100树脂100 mL，加入玻璃层析柱中，以含1 000 mL样品液的桃儿七水提物上样，不同体积分数的乙醇溶液（0％、20％、30％、40％、50％、60％、95％）以1.5 BV/h体积流量解吸附洗脱，然后真空干燥，称重，重复3次。HPLC法比较各溶液中的成分，见图2。并测定鬼臼毒素的含有量，见表2。

1.鬼臼毒素A.标准品溶液 B.上样水溶液 C.水洗脱液 D.20％乙醇洗脱液 E.30％乙醇洗脱液 F.40％乙醇洗脱液G.50％乙醇洗脱液 H.60％乙醇洗脱液 I.95％乙醇洗脱液图2　各溶液中的HPLC成分分析

表2　动态解吸附过程中不同浓度乙醇的洗脱能力

由此可知，以HPD100为吸附剂时，水、10％、20％乙醇只能将水溶性成分洗脱下来；30％乙醇的洗脱液中可见很少量的鬼臼毒素；从40％乙醇开始，大量鬼臼毒素被洗脱下来；到60％乙醇时，可几乎将鬼臼毒素全部洗脱下来。综上所述，可用30％乙醇在不损失太多目标物的前提下，大量洗脱除去杂质，然后用60％乙醇对鬼臼毒素进行解吸附，最后用95％乙醇再生大孔吸附树脂柱。

2.5.2 洗脱体积及洗脱曲线研究 取已处理好的HPD100树脂20 mL，加入玻璃层析柱中，以400 mL桃儿七水提取样品液上样，蒸馏水洗脱至Mo1ish反应呈阴性，计算洗脱体积。30％乙醇溶液以1.5 BV/h体积流量洗脱，HPLC法动态检测至其中鬼臼毒素以峰面积比计算，不大于0.5％，计算洗脱体积。60％乙醇溶液以1.5 BV/h体积流量继续洗脱，每30 m L收集洗脱液，HPLC法测定鬼臼毒素含有量，真空干燥，称重，重复3次。

由表3、图3可知，20倍柱体积蒸馏水可以洗脱至Mo1ish反应呈阴性。30％乙醇洗脱溶液在不大于10倍柱体积时，不会损失太多目标物；9倍柱体积的60％乙醇溶液可以将大部分目标物解吸附；15倍柱体积的60％乙醇溶液可以将目标物完全解吸附。以HPD-100型大孔吸附树脂柱处理前后的总固物和鬼臼毒素为指标，发现大孔吸附树脂法可以有效去除杂质，使鬼臼毒素的含有量大幅度提高，而且其回收率达到90％以上。

表3　XDA-1大孔吸附树脂对鬼臼毒素的富集程度

2.5.3 60％乙醇洗脱体积流量研究 在上述研究的基础上，本实验进一步考察洗脱体积流量。取400 mL桃儿七水提取样品液3份，上样于20 mL已处理好的HPD100树脂，以20倍柱体积蒸馏水洗脱至Mo1ish反应呈阴性。10倍柱体积30％乙醇溶液洗脱后，再分别以0.5、1.5、3.0 BV/h的60％乙醇溶液洗脱，HPLC法动态监测至其中的鬼臼毒素以峰面积比计算，小于0.5％，计算洗脱体积。结果表明，以0.5、1.5、3.0 BV/h的60％乙醇溶液洗脱时，其洗脱体积分别为30、15、27倍柱体积，而且1.5 BV/h为最佳洗脱速度。

图3　鬼臼毒素的洗脱曲线

3 讨论

本实验研究了12种不同厂家、型号的大孔吸附树脂对桃儿七水提取物中鬼臼毒素的动、静态吸附与解吸附能力。结果表明，HPD100型树脂的吸附能力最好，并且60％乙醇溶液可作为解吸附溶剂，洗脱物中鬼臼毒素的含有量达28.46％，远高于水提取物中的1.58 ％。

乙醇及甲醇等有机溶剂为提取鬼臼毒素的常用溶剂，而苯更能特异性地溶解、纯化鬼臼毒素。但是，采用有机溶剂提取后，不能直接上样于大孔吸附树脂，这样一方面会增加溶剂回收的工艺流程和成本，而另一方面也会造成环境污染和生产中的安全问题。本实验采用较大量的水加热提取桃儿七药材，冷却后不经浓缩，直接上大孔吸附树脂柱吸附鬼臼毒素类成分，最后以少量乙醇溶液解吸附，获得较高含有量的鬼臼毒素提取物。该方法避免了大量使用有机溶剂，而且简便、快速、稳定，适合工业化生产。

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中图分类号：R284.2

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）01-0212-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.051

*通信作者：李茂星（1973—），男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为中药新药研究与开发。Te1：（0931）8994676，E-mai1：1imaox2005@a1iyun.com

作者简介：王谨慧（1977—），女，副主任中药师，研究方向为中药炮制与制剂工程。Te1：13919917221

收稿日期：2014-11-03