HPLC法测定猪胆粉中的牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸

谭春梅， 陆静娴， 王征南

（浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州310004）



HPLC法测定猪胆粉中的牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸

谭春梅， 陆静娴， 王征南

（浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州310004）

摘要：目的 建立HPLC-UV法同时测定猪胆粉中牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸的含有量。方法 猪胆粉甲醇提取液采用Kromasi1C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析；流动相乙腈-0.03 mo1/L磷酸二氢钠，梯度洗脱；体积流量1.0 m L/min；柱温25℃；检测波长200 nm。结果 牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸分别在0.087 7～4.384 9 μg（r=1.000 0）、0.257 8～8.594 6 μg（r=1.000 0）范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率在95.0％～105.0％之间，RSD均小于3.0％。结论 该方法简单、可靠，适用于猪胆粉的质量控制。

关键词：猪胆粉；牛磺猪去氧胆酸；甘氨猪去氧胆酸；HPLC

猪胆粉为猪科动物猪Susscrofa domestica Brisson胆汁的干燥品，具有清热润燥、止咳平喘、解毒的作用，用于顿咳、哮喘、热病燥渴、目赤、喉痹、黄疸、泄泻、痢疾、便秘、痈疮肿毒［1］。现代药理学研究表明，猪胆粉具有明显的抗炎、镇静、抗肿瘤作用［2-3］，其主要成分为胆汁酸，包括结合型和游离型胆酸，以前者为主。目前，相关研究基本集中在后者［4-8］，而且在测定其含有量时基本采用水解后测定或柱前衍生化法，专属性不强，但对占比较高、活性较强的结合型胆酸的研究较少［9-10］。因此，本实验采用HPLC-UV法测定猪胆粉中含有量较高的结合型胆酸牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸，用以更好的控制其质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Ag1ient 1200高效液相色谱仪（美国Agi1ent公司）；赛多利斯CP225D电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试药 牛磺猪去氧胆酸（111943-201301）对照品（中国食品药品检定研究院）；甘氨猪去氧胆酸对照品（G641390）（加拿大多伦多研究化学品公司，纯度98％）。乙腈、甲醇为色谱纯；水为重蒸水。猪胆粉10批，批号分别为120401、120502、120603、120906、121002、121004、121005、121105、121205、130105（福建省仙游县南丰生化有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasi1-C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5.0 μm）；流动相乙腈（A）-0.03 mo1/L磷酸二氢钠（B，磷酸调pH=4.4），梯度洗脱（0～40 min，28％→36％ A，72％→64％ B）；检测波长200 nm；体积流量1.0 mL/min；检测波长200 nm；柱温25℃；进样量10 μL。对照品及供试品色谱图见图1。

1.牛磺猪去氧胆酸 2.甘氨猪去氧胆酸1.taurohyodeoxycho1ic acid 2.g1ycy1hyodeoxycho1ic acid图1　混合对照品和样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms ofm ixed reference substances and sam ples

2.2 混合对照品溶液的配制 精密称取牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含0.1和0.3 mg相应成分的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取本品（批号120502）粉末约0.1 g，置于50 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超声（500 W、40 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10 μL进样分析，即得。

3 方法学考察

3.1 线性关系 分别配制系列浓度牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸的对照品溶液（n =6），在“2.1”项色谱条件下进样分析。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到两者的回归方程分别为y=458.95x+ 5.235（r=1.000 0）、y=568.84x+1.390 4（r= 1.000 0）。结果表明，牛磺猪去氧胆酸在0.087 7～4.384 9 μg，甘氨猪去氧胆酸在0.257 8～8.594 6 μg范围内线性关系良好

3.2 精密度试验 取一定浓度的混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，每次10 μL，记录牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸峰面积。结果，两者的峰面积RSD分别为0.8％和1.0％，表明仪器精密度良好。

3.3 稳定性试验 取猪胆粉供试品（批号120502）适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在0、2、4、8、17、25 h进样测定峰面积。结果，牛磺猪去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸的峰面积RSD分别为1.7％和0.8％，表明供试品溶液在25 h内稳定。

3.4 重复性试验 取猪胆粉供试品（批号120502）适量，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液进行测定。结果，牛磺猪去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸的峰面积RSD分别为2.3％和1.1％，表明该方法重复性良好。

3.5 加样回收率 称取含有量已知的供试品（批号120502）约20 mg，共6份，置于25 mL量瓶中，分别加入0.069 06 mg/mL牛磺猪去氧胆酸10.0 mL和0.923 9 mg/mL甘氨猪去氧胆酸4.0 mL，适量甲醇溶解，超声（500 W、40 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，在“2.1”项色谱条件下进样10 μL，计算加样回收率，结果见表1。

表1　加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

3.6 样品测定 取10批供试品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并测定牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸的含有量，结果见表2。

表2　牛磺猪去氧胆酸和甘氨猪去氧胆酸含有量Tab.2 Contents of taurohyodeoxycholic acid and glycohyodeoxycholic acid

4 讨论

结合型胆酸属于末端吸收，本实验采用二极管阵列检测器，记录200～400 nm范围内的光谱图，结果发现在200 nm波长处色谱峰响应均较大，基线噪音较小，因此选择200 nm作为检测波长。另外，甲醇在205 nm处有末端吸收，故采用乙腈-磷酸盐流动相进行梯度洗脱，能获得较好的分离效果，而且噪音波动较小。

选择色谱柱时，考察了Kromasi1-C18、Shimaduzu-C18、Diamonsi1-C18（4.6 mm×25 mm，5 μm），结果发现除色谱峰保留时间略有变化外，对色谱峰的分离度及峰形均无明显影响。

选择柱温时，考察同一根C18色谱柱对同一份供试品溶液（批号120502）分别在柱温20、25、30℃进行测定，结果发现柱温对样品分离度无明显的区别，但在25℃下分离最为理想，故规定柱温为25℃。

很多文献以测定猪胆粉中水解产物为主，但水解后成分不专属，本实验采用HPLC-UV法测定猪胆粉中结合型胆酸类成分甘氨猪去氧胆酸和牛磺猪去氧胆酸，具有较高的专属性，而且方法较简便，能够快速的测定猪胆粉中该两类成分的含有量。

参考文献：

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［2］ 宋立人.现代中药大辞典：第二卷［M］.北京：人民卫生出版社，2001.

［3］ 李培锋，何秀玲，关 红，等.牛磺鹅去氧胆酸的抗炎作用机理［J］.中国兽医学报，2008，28（11）：1317-1320.

［4］ 张贇华，刘建忠，彭 霞，等.HPLC法比较熊胆粉及猪胆粉、牛胆粉、羊胆粉和鸡胆粉中胆汁酸类成分［J］.药物分析杂志，2009，29（3）：487-490.

［5］ 唐元军，陈育林，陈庆辉.HPLC-ELSD法同时测定猪胆粉中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量［J］.中药新药与临床药理，2010，21（6）：651-653.

［6］ 陈 勇，李文霞，马临科.RP-HPLC测定猪胆粉薄荷脑软膏中猪去氧胆酸的含量［J］.中国药品标准，2008，9 （1）：53-55.

［7］ 陈志维，黎玉翠，暴梅佳，等.柱前衍生化高效液相色谱法测定猪胆粉结合胆酸中甘氨酸和牛磺酸的含量［J］.药物分析杂志，2010，30（2）：288-290.

［8］ 李志万，马 强，袁永生，等.HPLC-ELSD法对猪胆粉中猪去氧胆酸的含量测定研究［J］.中国实验方剂学杂志，2005，11（5）：14-16.

［9］ 何 姣，李 静，朱 砂，等.RP-HPLC法同时测定猪胆粉药材中3种牛磺结合型胆酸的含量［J］.药物分析杂志，2012，32（2）：229-232.

［10］ 何 姣.猪胆粉中结合型胆甾酸的化学成分及生物活性研究［D］.西安：西北大学，2012.

［饮片炮制］

Determ ination of taurohyodeoxycholic acid and glycohyodeoxycholic acid in Pulvis Fellis Suis by HPLC

TAN Chun-mei， LU Jing-xian， WANG Zheng-nan
（Zhejiang Provincial Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 31OOO4，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLCmethod for determining taurohyodeoxycho1ic acid and g1ycohyodeoxycho1ic acid in Pulvis Fellis Suis.METHODS The ana1ysis of Pulvis Fellis Suismethano1ic extractwas performed on Kromasi1C18co1umn（4.6 mm×250 mm，5 μm），mobi1e phase was acetonitri1e-0.03 mo1/L sodium dihydrogen phosphate with gradiente1ution，f1ow ratewas1.0 mL/min，co1umn temperaturewasmaintained at25℃，and detection wave1ength was set at200 nm.RESULTS Taurohyodeoxycho1ic acid and g1ycohyodeoxycho1ic acid hadbook=123,ebook=129good 1inear re1ationships in the ranges of 0.087 7 -4.384 9 μg（r=1.000 0）and 0.257 8 -8.594 6 μg（r= 1.000 0），respective1y.The average recoverieswere 95.0％ -105.0％.The RSDswere 1ess than 3.0％.CONCLUSION Thismethod is simp1e and re1iab1e，which is suitab1e for the qua1ity contro1of Pulvis Fellis Suis.

KEY WORDS：Pulvis Fellis Suis；taurohyodeoxycho1ic acid；g1ycohyodeoxycho1ic acid；HPLC

作者简介：谭春梅（1983—），女，硕士，主管中药师，从事药品标准制定和质量检验工作。Te1：（0571）86459425，E-mai1：tanchunmei83@163.com

收稿日期：2015-03-20

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.027

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）01-0122-04