普乐安片HPLC指纹图谱研究

程巧鸳， 张文婷， 陈碧莲， 郑 成， 郑瑜倩

（1.浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州310022；2.浙江中医药大学，浙江杭州310053）



普乐安片HPLC指纹图谱研究

程巧鸳1， 张文婷1， 陈碧莲1， 郑 成1， 郑瑜倩2

（1.浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州310022；2.浙江中医药大学，浙江杭州310053）

摘要：目的 建立普乐安片（油菜花粉）HPLC指纹图谱。方法 普乐安片甲醇提取液的分析在C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）上进行；乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱；检测波长265 nm；柱温40℃。LC/MS/MS法以白麻苷为参照峰，对样品进行相似度评价。结果 辅料、茶花粉、荷花粉、荞麦花粉、向日葵花粉、玉米花粉和油菜花粉能被区分开，全国5家企业生产的35批样品的相似度为0.856～0.999。结论 除4批样品的相似度低于0.900外，普乐安片的质量相对可靠。

关键词：普乐安片；指纹图谱；HPLC；LC/MS/MS

普乐安片为油菜花粉加辅料制成的单味药制剂，具有补肾固本的作用，主要用于肾气不固，腰膝酸软，尿后余沥或失禁及慢性前列腺炎、前列腺增生具有上述症候者。根据文献报道［1-8］，油菜花粉的主要化学成分为蛋白质、脂肪酸、氨基酸、维生素等多种营养成分及甾醇、黄酮、多肽、辅酶、皂苷等活性物质，其中甾醇和黄酮类成分具有明显的抗前列腺增生活性。油菜花粉的质量标准为2001年浙江省食品药品监督管理局发布的药材标准，质控项目单一。相应制剂普乐安片的质量标准收载于《中国药典》2010年版一部第一增补本，包括显微鉴别、薄层鉴别及总黄酮醇苷定量测定，但尚未建立反映整体信息的指纹图谱，且难以有效甄别是否其他花粉投料如茶花粉、荞麦花粉、向日葵花粉、玉米花粉等，因此需进一步建立专属性更强的质控项目以保障其质量。

中药指纹图谱因能表征中药的整体信息，目前在中药质量评价方面得到了广泛认可。在前期实验基础上［9］，采用LC/MS/MS法对特征峰进行指认，建立经方法学验证的普乐安片HPLC指纹图谱，并对全国5家企业生产的35批样品进行相似度评价，为进一步提高普乐安片的质量标准、更好地控制产品质量奠定基础。

1 仪器与试药

LC-20AT高效液相色谱仪，配备DGU-20A5在线脱气机、四元梯度泵、SIL-20AC自动进样仪、CTO-20AC柱温箱、SPD-M20A二极管阵列检测器（日本Shimadzu公司）；Agi1ent LC1200-Agi1ent 6430 Trip1e Quad LC/MS液-质谱联用仪（美国Agi-1ent公司）；AE 240电子天平（瑞士Mett1er公司）；Centrifuge 5430R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。乙腈、甲酸为色谱纯（德国Merck公司）；甲醇为分析纯（安徽时联特种溶剂股份有限公司）；水为超纯水（美国Mi1ipore公司）和纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。白麻苷（西北大学生命科学学院赵英永副教授自制并惠赠，纯度大于95％）。普乐安片（浙江康恩贝制药股份有限公司，批号分别为130139、130141、130142、130143、130144、130145、130146、130147、130148、130149，规格0.57 g/片；甘肃河西制药有限责任公司，批号分别为120106、120205、120209、120305、120309、120405、120409、120413、120112、111006，规格0.56 g/片；安徽新陇海药业有限公司，批号分别为121116、121117、121118、121119、121120，规格0.5 g/片；包头中药有限责任公司，批号分别为1212301、1212303、1212304、1212307、1212309，规格0.55 g/片；楚雄老拨云堂药业有限公司，批号分别为130101、130102、130103、130104、130107，规格0.56 g/片），共35批，研究用样品批号为130139。油菜花粉（批号120825）、茶花粉（批号111206）、荷花粉（批号120715）、荞麦花粉（批号120710）、向日葵花粉（批号120721）、玉米花粉（批号120806）由浙江康恩贝制药股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 We1ch U1timate©XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.4％磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～60 min，5％～60％ B）；体积流量1.0 mL/min；检测波长265 nm；柱温40℃；进样体积10μL。

2.2 参照物溶液的制备 取白麻苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含30 μg白麻苷的溶液，作为参照物溶液Ⅰ。另取油菜花粉对照药材约0.25 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流30 min，冷却，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为参照物溶液Ⅱ。

2.3 供试品溶液的制备 取普乐安片样品10片，研细，取约0.25 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备参照物溶液Ⅱ，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 取空白辅料、茶花粉、荷花粉、荞麦花粉、向日葵花粉、玉米花粉和油菜花粉，按“2.2”项下方法制备参照物溶液Ⅱ，在“2.1”项色谱条件下，记录色谱图，见图1。结果显示，空白辅料对样品的测定无干扰，油菜花粉色谱图中呈现分离良好的特征峰，表明本方法的专属性良好。

A.玉米花粉 B.向日葵花粉 C.荞麦花粉 D.荷花粉 E.茶花粉 F.油菜花粉 G.辅料A.corn po11en B.sunf1ower po11en C.buckwheat po11en D.1otus po11en E.came11ia po11en F.rape po11en G.excipients图1　不同种类花粉及辅料液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of different types of pollens and excipients

2.4.2 精密度试验 取样品（批号130139），按“2.3”项下方法制备，在“2.1”项色谱条件下，重复进样6针，记录色谱图，以6针平均值为模板，计算相似度。结果，各色谱图相似度的RSD小于0.01％，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取样品（批号130139），按“2.3”项下方法制备，平行6份，在“2.1”项色谱条件下，记录色谱图，以6份平均值为模板，计算其相似度。结果，各色谱图相似度的RSD小于0.01％，表明本方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取样品（批号130139），按“2.3”项下方法制备，在“2.1”项色谱条件下，分别在0、2、4、6、8、12、24、36 h记录色谱图，以0 h色谱图为模板，计算其相似度。结果，各色谱图相似度的RSD为0.1％，表明供试品溶液在36h内稳定。

2.4.5 相似度评价 运用上述分析方法，建立35批普乐安片样品的指纹图谱，选取色谱峰信息量较大的10批样品，应用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）”软件，生成对照指纹图谱，计算35批样品的相似度值，见表1。从表中可以看出，相似度在0.950～0.999者共29批，0.900～0.950者共2批，0.856～0.900者共4批，表明目前普乐安片的质量相对可靠，但不同企业产品的质量仍有差异，因此建立指纹图谱可使质量更为可控。

表1　35批普乐安片的相似度值Tab.1 Sim ilarity values of 35 batches of Pule'an Tablets

2.5 指纹图谱中参照峰的设定

2.5.1 质谱条件 色谱条件同“2.1”项。流动相为乙腈-0.1％甲酸溶液；ESI源，正离子模式；Fu11Scan扫描方式；雾化室压力35 psi（1 psi= 6.895 kPa）；雾化温度350℃；毛细管电压4 000 V；干燥气体积流量9.0 L/min；扫描范围m/z50～1 000；碎裂电压135 V；与紫外检测器并联分流。

2.5.2 参照峰确证 上述质谱条件下所得HPLC 和TIC图见图2。从图中可知，HPLC图中1～9号峰在TIC图中响应良好。提取MS图发现，1号峰为槲皮素连接两个6C糖（特征离子627.2，465.1，303.1）的黄酮苷；3号峰特征离子（438.2，292.2，147.0）；2、4号峰为山柰素连接两个6C糖（特征离子611.2，449.1，287.1）的黄酮苷，可能为同分异构体；5号峰特征离子（687.4，657.3，541.3，495.3，344.1，193.1）；6、7号峰特征离子（881.1，851.2，441.1，426.0，352.2）可能为同分异构体；8、9号峰特征离子（865.1，835.2，666.2，433.1，418.1，352.1）也可能为同分异构体。通过UV光谱扫描和Product Ion扫描证实，1号峰为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷，即白麻苷，与文献报道一致［10-11］，见图3～5。2、4号峰可能为文献报道的山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷或山柰酚-3，4′-双-O-β-D-葡萄糖苷［10］，由于缺乏相关对照品，故尚未能确证。3、5、6、7、8、9号峰相关文献报道较少，推测可能为皂苷或其他未知成分。

图2　普乐安片TIC和HPLC图Fig.2 TIC and HPLC chromatogram s of Pule'an Tablets

图3　参照物和普乐安片液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of reference materials and Pu le'an Tablets

图4　白麻苷和普乐安片1号峰紫外光谱图Fig.4 UV spectrum of baimaside and Peak 1 of Pule'an Tablets

图5　白麻苷和普乐安片1号峰质谱图Fig.5 M ass spectrum of baimaside and Peak 1 of Pule'an Tablets

3 讨论

3.1 提取条件的考察 为能在一张色谱图中尽可能多地反应化合物信息，本实验比较了不同提取溶剂（50％甲醇和甲醇）对色谱信息的影响。结果，以50％甲醇为提取溶剂时色谱图中的信息量明显少于甲醇为提取溶剂，故选择甲醇为提取溶剂。

3.2 色谱条件的优化 本实验曾对色谱条件进行优化，以使白麻苷参照峰与相邻色谱峰及其余各峰达到最佳分离，试验了不同流动相组成及梯度。结果，乙腈-磷酸水溶液系统可达到良好分离，比较了不同柱温（25、30、35、40和45℃）对色谱分离的影响，发现柱温40℃时，白麻苷参照峰与相邻色谱峰能完全分离，且其余各峰的分离良好，说明白麻苷成分对柱温较敏感，增加柱温可使分离度提高。试验中还比较了不同色谱柱对分离的影响，结果不同品牌色谱柱分离均良好，各色谱柱相似度的RSD为0.6％，表明色谱柱的耐用性良好。

3.3 普乐安片质量评价 本实验共测定了全国5家企业生产的35批普乐安片样品，结果4批样品的相似度低于0.900。由于普乐安片的原料药油菜花粉的产地相对比较集中，主要产自于青海、甘肃两省，且制剂的制备工艺简单，故目前普乐安片的质量相对可靠，但也有个别企业个别批次的样品质量较差，可能与原料来源及质控项目单一有关。本实验采用对照品保留时间比对及质谱法确证设定参照峰，并经色谱条件考察优化后建立指纹图谱，可为保障普乐安片的批间稳定性、质量可靠性奠定实验基础。

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HPLC fingerprint of Pule'an Tablets

CHENG Qiao-yuan1， ZHANGWen-ting1， CHEN Bi-1ian1， ZHENG Cheng1， ZHENG Yu-qian2
（1.Zhejiang Provincial Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 31OO22，China；2.Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 31OO53，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLC fingerprint of Pu1e'an Tab1ets（po11en of brassica campestris L.）. METHODS The ana1ysis of Pu1e' an Tab1ets methano1ic extract was deve1oped on C18co1umn（4.6 mm× 250 mm，5 μm）at40℃，with acetonitri1e-0.4％ phosphoric acid so1ution as themobi1e phase in a gradient e1ution manner，1.0 mL/min for f1ow rate and 265 nm for detection wave1ength.Baimasidewas confirmed as the reference peak for LC/MS/MS.A simi1arity ana1ysiswas then carried on among samp1es' eva1uation.RESULTS The differences among rape po11en，excipients，po11ens of came11ia，1otus，buckwheat，sunf1ower and corn cou1d be identified.The simi1arities of thirty-five batches of Pu1e'an Tab1ets from fivemanufacturerswerewithin the ranges of 0.856 -0.999.CONCLUSION Except for the four batches under a simi1arity va1ue of0.900，amajority of Pu1e'an Tab1ets in themarket are re1iab1e in qua1ity.

KEY WORDS：Pu1e'an Tab1ets；fingerprint；high performance 1iquid chromatography（HPLC）；LC/MS/MS

作者简介：程巧鸳（1981—），女，副主任中药师，从事中药药效物质基础及质量安全研究。Te1：（0571）86459425

基金项目：国家自然科学基金（NSFC 81303213）；浙江省自然科学基金（LQ12H28001）

收稿日期：2015-05-18

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.020

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）01-0094-04