HPLC波长切换法同时测定复方苁蓉散中松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷

曾建伟， 张珍丽， 钟 黎， 陈发兴， 蔡 晶*

（1.福建中医药大学，福建福州350122；2.国家知识产权专利审量协作北京中心，北京100081；3.福建农林大学园艺学院，福建福州350002）



HPLC波长切换法同时测定复方苁蓉散中松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷

曾建伟1， 张珍丽2#， 钟 黎1， 陈发兴3， 蔡 晶1*

（1.福建中医药大学，福建福州350122；2.国家知识产权专利审量协作北京中心，北京100081；3.福建农林大学园艺学院，福建福州350002）

摘要：目的 建立HPLC波长切换法同时测定复方苁蓉散（肉苁蓉、淫羊藿、黄精）中松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷的含有量。方法 复方苁蓉散50％甲醇提取液分析采用Agi1ent HC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1％磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱；体积流量为1.0 mL/min；检测波长为330 nm（0～20 mim，松果菊苷和毛蕊花糖苷）和270 nm（20～30 mim，淫羊藿苷），柱温30℃。结果 松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷分别在142.4～2 848 ng（r=0.999 5）、19.92～398.4 ng（r=0.999 8）和19.60～392.0 ng（r=0.999 9）范围内，与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率（n =6）分别为99.03％、99.97％、99.50％。结论 该方法简便、准确、可靠，可用于复方苁蓉散中上述3种成分的质量控制。

关键词：复方苁蓉散；松果菊苷；毛蕊花糖苷；淫羊藿苷；HPLC；波长切换

复方苁蓉散是根据中医补肾益髓理论，结合临床和科研实验结果组成的中药复方，已获得国家授权发明专利（授权专利号201110302854.1），该方由肉苁蓉10 g、淫羊藿10 g、黄精18 g组成。方中肉苁蓉味甘、咸，性温，归肾、大肠经，有补肾阳、益精血的功效，取其“阴阳双补”，为君药；淫羊藿味辛、甘，性温，归肾、肝经，能补肾阳、强筋骨，取其补益肾阳助君药之力，为臣药；其他为佐使药。临床主要用于治疗阿尔茨海默病（A1zheimer' s disease，AD）和帕金森病（Parkinson' s disease，PD）等老年性疾病［1-2］。已有研究表明，肉苁蓉总苷及其松果菊苷对AD、PD及血管性痴呆患者具治疗作用［3-6］，淫羊藿总黄酮及其淫羊藿苷对AD和血管性痴呆具防治作用［7-10］。虽有对单味药材的质控方法［11-15］，但无复方苁蓉散的质量标准。本实验采用HPLC同时测定方中松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷的量，为复方苁蓉散的质量控制提供一种方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agi1ent 1200高效液相色谱仪，包括G1311A四元泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1315D二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）；LK-1000A摇摆式中药粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）；MS105DU十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AR2130千分之一电子天平（美国奥豪斯仪器有限公司）；KQ-500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Mi11i-Q超纯水机（美国Mi11ipore公司）。乙腈为色谱纯；水为超纯水；甲醇、磷酸等均为分析纯。

1.2 试药 松果菊苷（批号111670-200503）、毛蕊花糖苷（批号111530-200505）、淫羊藿苷（批号110737-2004153）均购自中国食品药品检定研究院。肉苁蓉、淫羊藿、黄精均购自福建中医药大学国医堂，经本校梁一池教授分别鉴定为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma的干燥带鳞叶的肉质茎、小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.的干燥叶、百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum co11.et Hems1的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agi1ent HC-C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.1％磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，10％→20％A； 10～15 min，20％→30％A；15～30 min，30％A）；体积流量1.0 mL/min；检测波长330 nm（0～20 min）、270 nm（20～30 min）；进样量10 μL；柱温30℃。

2.2 混合对照品溶液 精密称取松果菊苷对照品7.12 mg、毛蕊花糖苷对照品4.98 mg和淫羊藿苷对照品4.90 mg，分别置于25 mL量瓶中，用50％甲醇溶解，并稀释至刻度，得到贮备液。分别精密吸取3种贮备液5、1、1 mL，置于10 mL量瓶中，加入50％甲醇稀释，并定容至刻度，得到质量浓度分别为142.4、19.92、19.60 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液 取复方苁蓉散粉末约0.76 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加50％甲醇溶液至刻度，静置30 min，超声（功率300 W、频率50 kHz）处理40 min，放冷，定容，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液 按处方比例，分别称取不含肉苁蓉、不含淫羊藿的药材粉末，按“2.3”项下方法制备缺肉苁蓉、缺淫羊藿的阴性对照溶液。

2.5 系统适应性试验 分别精密吸取对照品溶液，阴性对照溶液及供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下进样分析，结果见图1。表明阴性样品对检测无干扰，样品与对照品在相同保留时间处有色谱峰，而阴性样品无色谱峰，说明样品中其他成分对待测成分无干扰。而且，3个成分与相邻色谱峰均能达到基线分离，分离度均大于1.5。

2.6 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液1、5、10、15、20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

表1　松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的回归方程、相关系数和线性范围Tab.1 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges of echinacoside，verbascoside and icariin

2.7 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，重复进样6次，记录色谱峰面积，计算松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷峰面积的RSD分别为1.1％、1.4％、1.3％，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，每隔2 h进样一次，共6次，记录色谱峰面积，计算复方苁蓉散中松果菊苷，毛蕊花糖苷、淫羊藿苷峰面积的RSD分别为1.6％、2.1％、0.92％，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.9 重复性试验 取同一批复方苁蓉散粉末0.76 g，共6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，记录峰面积，计算复方苁蓉散中松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的平均含有量分别为1.376、0.138、0.193 mg/g，RSD分别为1.3％、1.9％、1.7％，表明该方法重复性良好。

2.10 回收率试验 精密称取含有量已知的复方苁蓉散（批号20150201）粉末0.38 g，共6份，分别置25 mL量瓶中。另取12.5 mL松果菊苷储备液置25 mL量瓶中，2.5 mL毛蕊花糖苷储备液置10 mL量瓶中、2.5 mL淫羊藿苷贮备液置10 mL量瓶中，分别加50％甲醇，稀释至刻度。于盛有样品的量瓶中，分别精密加入上述松果菊苷溶液3.5 mL、毛蕊花糖苷溶液1.0 mL、淫羊藿苷溶液1.5 mL，再加50％甲醇至刻度。按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，计算松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的平均回收率，见表2。

表2　松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的回收率试验结果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for echinacoside，verbascoside and icariin（n=6）

2.11 样品测定 精密称取样品5批，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，记录峰面积，并按外标法计算，结果见表3。

表3　复方苁蓉散中松果菊苷、毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的含有量Tab.3 Contents of echinacoside，verbascoside and icariin in Compound Congrong Powder

3 讨论

3.1 检测波长 二极管阵列检测器于200～400 nm在线扫描可知，松果菊苷和毛蕊花糖苷在330 nm处有最大吸收峰，而淫羊藿苷在330 nm则无吸收峰。虽然淫羊藿苷在270 nm处有最大吸收峰，但松果菊苷和毛蕊花糖苷在270 nm处为峰谷位置，若采用单一检测波长，很难兼顾3种成分的检测灵敏度，故在同一信号通道中设置了波长切换，使各成分均能在最高灵敏度下被检测。

3.2 流动相 由于被检测成分含有多个酚羟基，呈弱酸性，故在流动相中加入0.1％磷酸以抑制解离，防止峰的拖尾。有机相若用甲醇，峰变矮变钝，因此选用乙腈，峰形变锐。若用等度洗脱，淫羊藿苷峰与前面的毛蕊花糖苷出峰相距甚远，保留时间太长，故采用梯度洗脱，在保证分离度的前提下，拉近了两峰的距离。经过不断优化，将流动相确定为乙腈-1％磷酸，梯度洗脱。

3.3 结果分析 由表3可知，不同批次的含有量检测结果无显著性差异，说明复方苁蓉散的调剂准确、质量稳定、方法可行。所建立的检测方法适用于复方苁蓉散中松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷的质量控制，可为制订本方其它制剂的质量标准提供参考。

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Simultaneous determ ination of echinacoside，verbascoside and icariin in Compound Congrong Powder by HPLC wavelength sw itching

ZENG Jian-wei1， ZHANG Zhen-1i2#， ZHONG Li1， CHEN Fa-xing3， CAIJing1*
（1.Fujian University of Traditional ChineseMedicine，Fuzhou 35O122，China；2.Patent Examination Coopration Center of The Patent Office，SIPO，Beijing 1OOO81，China；3.College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 35OOO2，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLC wave1ength switchingmethod for simu1taneous1y determining the contents of echinacoside，verbascoside and icariin in Compound Congrong Powder（Cistanche deserticola Y.C.Ma，Epimedium brevicornu Maxim.and Polygonatum kingianum co11.et Hems1）.METHODS The ana1ysis of Compound Congrong Powder 50％ methano1ic extract was performed on Agi1ent HC-C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm）maintained at30℃，with acetonitri1e（A）-0.1％ phosphoric acid so1ution（B）as the mobi1e phase in a gradiente1ution manner ata f1ow rate of1.0 mL/min.The detection wave1engthswere 330 nm for echinacoside and verbascoside（0 -20 mim）and 270 nm for icariin（20 -30 mim）.RESULTS Themethod achieved good 1inearities in the ranges of142.4 -2 848 ng（r=0.999 5）for echinacoside，19.92 -398.4 ng（r=0.999 8）for verbascoside and 19.60 -392.0 ng（r=0.999 9）for icariin.Their average recoveries（n =6）were 99.03％，99.97％ and 99.50％，respective1y.CONCLUSION Thismethod is simp1e，accurate and re1iab1e，which can be used for the qua1ity contro1of three components in Compound Congrong Powder.

KEY WORDS：Compound Congrong Powder；echinacoside；verbascosid；icariin；HPLC；wave1ength switching

*通信作者：蔡 晶（1969—），女，教授，研究方向为中西医结合老年神经病学。E-mai1：caij1@163.com

作者简介：曾建伟（1976—），男，副研究员，研究方向为中药分析及质量评价。Te1：15859161976，E-mai1：zjwtcm@qq.com#并列第一作者：张珍丽（1976—），女，副研究员，研究方向为知识产权。E-mai1：zhangzhen1i@sipo.gov.cn

基金项目：国家卫生和计划生育委员会科研基金（WKJ-FJ-38）；福建省社发重点项目（2013Y0059）；校管-重点学科专项（X2014010-学科）

收稿日期：2015-03-10

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.017

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）01-0084-04