雁门苦荞黄酮的分离提取、稳定性及抗氧化活性研究

付丽红，李晓斌，董正中，薛亮

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 工学院，山西 太谷 030801)



雁门苦荞黄酮的分离提取、稳定性及抗氧化活性研究

付丽红1，李晓斌2，董正中1，薛亮1

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 工学院，山西 太谷 030801)

摘要：以雁门苦荞为研究对象，采用Box-Behnken响应面分析法，对苦荞黄酮提取工艺进行优化，并探索其稳定性和抗氧化活性。结果表明：苦荞黄酮提取最佳工艺参数为乙醇质量分数77%、料液比40∶1、温度50 ℃和浸提液pH值5.6，总黄酮提取率为93.342%。同时，苦荞黄酮在pH 3～7范围内能稳定存在，温度、光照和金属离子(K+、Na+、Fe2+、Fe3+和Mg2+)对其影响作用小。当黄酮浓度为0.4 g·L-1时，对·DPPH和·OH清除率分别为83.70%和82.49%，并且其还原性随着浓度的增加而提高，表明雁门苦荞黄酮具有好的抗氧化活性。

关键词：雁门苦荞； 黄酮； 稳定性； 抗氧化

苦荞(Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn)学名鞑靼荞麦，属蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)，为一年生植物，是稀有的药食两用作物，在《本草纲目》和《千金要方》均有记载。2008年，Ishii等[1]将苦荞乙醇提取物作用于脂多糖诱导小鼠，显著提高了小鼠脾脏和肝脏中炎性细胞因子IL-6和TNF-α表达水平，表明苦荞具有抗炎症作用。Wang[2]等用苦荞提取物灌胃高血脂大鼠，发现其能显著降低大鼠血清和肝脏中甘油三酯和胆固醇水平，提高血清中抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化。同时，苦荞又具有抑菌[3]、调节血脂[4]和降低胆固醇[5]等作用。研究发现苦荞主要的功能化合物是黄酮类化合物，如芦丁、槲皮素、异槲皮素、山奈酚和山奈酚-3-O-芸香糖苷[6～8]。因此，黄酮提取和功能活性研究成为苦荞研究的热点。

我国是世界苦荞第一生产和出口大国，其产量占世界总量的90%以上。山西是全国为数不多的苦荞种植区之一，仅次于云南、四川、贵州和陕西，常年苦荞种植面积达1.3万公顷，产量约5万吨，占全国苦荞总量的1/10。山西省苦荞种植虽规模不大，但产区集中，雁北地区是苦荞重要种植地之一，雁门苦荞是其特色杂粮[9]。本研究以生长在海拔1 400 m的雁门苦荞为原料，采用醇提法分离纯化苦荞中黄酮类化合物，研究其稳定性和抗氧化活性，为雁门苦荞的综合利用和深度开发提供理论依据和基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

以山西右玉县出产的雁门苦荞为研究对象，由山西臣丰食品有限公司提供。芦丁、无水乙醇、DPPH、NaNO2、TBA、Al(NO3)3、FeSO4、α-脱氧核糖等均为分析纯。

所用仪器设备主要有：FW100高速万能粉碎机，苏州江东精密仪器公司；85-2A数显磁力搅拌器，江苏金怡仪器有限公司；SHA-C恒温水浴振荡器，上海华邻实业有限公司；FA1204B电子分析天平，上海精科天贸公司；SHZ-III型循环式真空泵，郑州紫拓仪器公司；SP-752/752PC紫外分光光度计，上海光谱公司。

1.2试验方法

1.2.1黄酮提取工艺

雁门苦荞颗粒经高速粉碎机磨成粉，过100目筛子，称取2 g于200 mL三角瓶中，按照不同料液比加入一定质量分数的乙醇溶液，用0.1 mol·L-1HCl或NaOH调节pH后，置于一定温度的恒温摇床中，100 r·min-1浸提1 h，真空抽滤获得上清液，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法于510 nm下测吸光值。

1.2.2响应面试验设计

为获得理想的黄酮提取条件，采用Box-Behnken设计试验，以乙醇体积分数/%、料液比(w/v)、浸提温度/℃和pH值4个因素为自变量，苦荞黄酮提取率为响应值。

1.2.3标准曲线绘制

分别取0.25 g·L-1芦丁标准溶液0、1、2、3、4、5、6 mL于25 mL比色管中，加蒸馏水至6 mL，加5%的NaNO21 mL，摇匀放置6 min，10%的Al(NO3)31 mL，摇匀后，静置6 min，4% NaOH试剂10 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，于510 nm测其吸光度。以吸光值横坐标，芦丁质量浓度为纵坐标建立标注曲线。

1.2.4黄酮提取率

黄酮提取率计算公式：

式中：c为黄酮含量/g·L-1；v提取液体积/mL；n为稀释倍数；m为采用乙醇回流提取，NaNO2-Al(NO3)3法测得苦荞总黄酮质量453 mg·g-1。

1.2.5稳定性测定

配置0.5 g·L-1苦荞黄酮待测溶液分别在温度、光照、pH和金属离子4个因素下观察其稳定性。各因素水平梯度设置如下：

(1)温度4、20、40、60、80和100 ℃，黄酮溶液在不同温度下静置30 min后测其吸光度；

(2)在日光下连续放置1周，每天测黄酮溶液吸光度；

(3)调制黄酮溶液pH值1、2、3、5、7和11，静置30 min后测其吸光度；

(4)黄酮溶液中分别添加0.05%的KCl、NaCl、MgCl2、FeCl2、FeCl3和CaCl2，反应1 h后测吸光度，观察金属离子对黄酮稳定性的影响。

1.2.6抗氧化活性测定

雁门苦荞黄酮抗氧化分析包括·DPPH自由基清除[10]、·OH自由基清除[11]和还原性检测[12]，具体方法见参考文献。

1.3数据分析

采用Design Expert 8.05b进行响应面分析，单因素采用SAS统计分析，数据以mean±SD表示，每个试验均进行3次平行测定。

2结果与分析

2.1标准曲线

以芦丁为标准物，NaNO2-Al(NO3)3比色法建立标准曲线回归方程：A=0.523 8C+0.000 1，R2=0.999 7。其中，A为吸光值，C为芦丁质量浓度。

2.2响应面设计与结果

响应面试验结果如表1所示。根据表1的响应面试验设计进行雁门苦荞黄酮提取优化，从试验结果可知，通过控制乙醇质量分数、料液比、温度和时间4个因素，黄酮提取率范围在33.098%～92.872%，波动范围大，表明设定的4个因素对苦荞黄酮的提取起关键性的影响。

注：A、B、C、D分别表示乙醇质量分数/%、料液比(w/v)、温度/℃和pH值。

Notes: A ethanol volume fraction/%, B solid-liquid ratio, C temperature/℃, D pH.

2.3方差分析结果

方差分析结果如表2所示。

由方差分析结果可知，在一次项中，A为显著影响(p=0.013 4)；在二次项中，B2和BD(p=0.022 9)为显著影响，C2和D2为极显著影响(p<0.01)。模型F=4.82，p=0.002 9，表明该模型显著，决定系数R2=0.828 1，说明模型具有较高的拟合精度。

采用Design-Expert 8.05b软件进行二次多项回归分析，得到苦荞黄酮提取率回归方程为：

Y=-185.715+2.058A+4.004B+2.036C+24.434D-0.069AD+0.169BD+0.021CD-0.012A2-0.039B2-0.0268C2-1.181D2

依据模型预测分析可知，当乙醇质量分数为77.26%、料液比40.72∶1、温度49.37℃、pH值5.62时，黄酮提取率为94.24%。根据实际条件，确定乙醇质量分数为77%、料液比40∶1、温度50℃、pH值5.6，此时测得黄酮提取率为93.342%，与理论误差为0.953%，表明该模型可以很好的预测黄酮提取率。

由图2可看出，当溶液pH值和温度一定时，较高水平的乙醇质量分数和中等水平料液比可以获得较高的黄酮提取率。同理，当溶液pH值和乙醇质量分数一定时，较高水平的料液比和中等水平温度可以获得较高的黄酮提取率(图3)；当溶液料液比和乙醇质量分数一定时，较高水平的温度和中等水平pH值可以获得较高的黄酮提取率(图4)。

2.4温度对黄酮稳定性的影响

如图5所示，在4～100 ℃范围内，苦荞黄酮吸光度都在一个稳定区间0.309～0.337，6个温度之间无显著差异。SAS统计结果表明，模型F值=1.61，显著性检验概率p=0.259 5，p值大于0.05，因此，温度对黄酮稳定性无影响，雁门苦荞黄酮可以在室温或低温下保存。

2.5光照对黄酮稳定性的影响

光照对雁门苦荞黄酮稳定性的影响见图6。由图6可知，苦荞黄酮溶液在自然光照下连续放置7 d，其吸光值稳定在0.340～0.347，SAS统计分析表明，模型F值=0.45，p=0.834，表明该模型不显著，即光照对苦荞黄酮无显著性影响。同时，不同时间段差异不显著。因此，雁门苦荞黄酮可以在日常环境中保存，无需避光。

2.6pH对黄酮稳定性的影响

pH对雁门苦荞黄酮稳定性影响如图7所示。结果表明，F值=196.97，p<0.000 1，说明该模型显著，溶液pH对苦荞黄酮稳定性有显著性影响。黄酮溶液pH值在3～7之间，其OD值在0.316～0.324范围内波动，彼此间差异不显著，当溶液的pH>9和pH<3时，OD值出现逐渐降低趋势。分析原因可能是黄酮类化合物分子中的酚羟基显示弱酸性，在碱性环境中，使黄酮化合物结构发生改变。另外，黄酮类化合物可能含有γ-吡喃环，含未共用电子对，在强酸条件下会生产盐类化合物，导致测定的OD值降低。因此，苦荞黄酮应保存在中性或弱酸环境中。

2.7金属离子对黄酮稳定性的影响

不同金属离子对雁门苦荞黄酮稳定性的影响见图8。SAS分析可知，F值=134.25，显著性检验概率p<0.001，表明该模型显著。当溶液中存在K+、Na+、Fe2+、Fe3+和Mg2+时，OD值在0.343～0.359之间，与空白相比，差异不显著。当加入Ca2+时，其OD值显著性提高为0.672，与其它组之间存在显著差异(P<0.05)，可能是因为提取的化合物中含有邻二酚羟基与钙反应生成不溶性络合物，影响反应溶液的吸光度。

2.8黄酮对·DPPH和·OH自由基清除率的检测

雁门苦荞黄酮对·DPPH和·OH自由基清除能力的影响详见图9。从图9可见，随着苦荞黄酮浓度的增加，对·DPPH和·OH自由基清除率逐渐增加，当黄酮浓度为0.4 g·L-1时，对两种自由基清除率达到稳定值，此时·DPPH清除率为83.70%，·OH自由基清除率为82.49%。分析原因是雁门苦荞黄酮类化合物既能与·DPPH自由基中的单电子配对，又能与·OH自由基作用减弱·OH对Fe2+的氧化，从而影响最终反应体系的吸光值。因此，苦荞黄酮能够很好的清除·DPPH和·OH自由基，具有抗氧化活性。

2.9还原能力检测

雁门苦荞黄酮还原性测定结果见图10。由图7可知，苦荞黄酮样品浓度从0.05 g·L-1到1.6 g·L-1，700 nm下测得吸光度由0.120逐渐增加到2.733，即随着样品浓度增加，还原性逐渐增强。分析原因，苦荞中的黄酮化合物可将K3[Fe(CN)6]还原成K4[Fe(CN)6]，再与Fe3+生成普鲁士蓝，通过测定其生成量反映苦荞黄酮类化合物的还原性。

3讨论

苦荞又名鞑鞑荞麦，双子叶廖科荞麦属，是富含生物类黄酮的杂粮作物。目前，我国苦荞种植面积和产量均居世界首位。苦荞品种资源丰富，收录在《中国荞麦品种资源目录》的苦荞有879份，不同地区都有自己的特色品种。秦培友[13]对21种苦荞品种的黄酮化合物含量进行测定，结果显示，贵州的梅花山苦荞品种总黄酮含量最高，为22.74 mg·g-1。本研究测得雁门苦荞总黄酮含量是该品种的20倍，含量差异主要与苦荞品种和种植环境有着密切关系。有机溶剂(乙醇)提取黄酮类化合物是一种简便有效的方法，其基本原理为利用黄酮类化合物分子结构-OH与杂质极性不同，进行黄酮类物质提取。本实验通过有机溶剂提取法，获得雁门苦荞黄酮提取率为93.342%。根据显著性检验概率p值，影响黄酮提取率的次序为：乙醇质量分数>pH>料液比>浸提温度。目前，从苦荞中分离出20多种黄酮类化合物，主要为芦丁、槲皮素、儿茶素、槲皮苷和槲皮素-3-芸香糖葡萄糖苷等，但雁门苦荞黄酮类化合物的成分尚未清楚，需要进一步深入探讨。

研究显示，雁门苦荞耐热性好，可在光照的环境中存放，金属离子K+、Na+、Fe2+、Fe3+和Mg2+对其无影响，但要注意环境的酸碱度，不宜在强酸或强碱条件下储存。许明等对2种苦荞黄酮粗提物进行研究，同样证明黄酮溶液耐高温[14]。因此，根据耐高温特性，可以将苦荞加工成各种食品，如苦荞茶和苦荞方便面等。

生物体呼吸代谢形成能源分子ATP维持机体生命活动，同时还会产生副产物活性氧(Reactive oxygen species，ROS)。正常条件下，体内的抗氧化系统会清除这些ROS，氧化和抗氧化系统处于平衡状态，但机体受到外界刺激后，处于氧化应激状态，过量的ROS会攻击体内的生物大分子如核酸、蛋白质和脂质，造成难以修复的细胞和组织损伤，形成各种疾病，如肿瘤、糖尿病、动脉硬化、心肌缺血等。因此，寻找高效的天然抗氧化物成为当前研究的热点。研究显示，雁门苦荞黄酮具有很好的抗氧化能力，因此，可以通过日常食用苦荞或开发苦荞黄酮类产品发挥其抗氧化功效。

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(编辑：马荣博)

Study on extraction, stability and antioxidant activity of flavonoids from YanmenFagopyrumtataricum

Fu Lihong1, Li Xiaobin2, Dong Zhengzhong1, Xue Liang1

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801China; 2.CollegeofEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801China)

Key words:YanmenFagopyrumtataricum; Flavonoids; Stability; Antioxidant

Abstract:The extraction technology of total flavonoids from YanmenFagopyrumtataricumwas studied by box behnken response surface methodology. And the stability and antioxidant activity of extracts were also detected. The processing parameters of extracting total flavonoids were as following: ethanol mass fraction 77%, solid-liquid ratio 40∶1, temperature of 50 ℃, pH value of 5.6. Finally, the total flavonoid rate was 93.342%. The flavonoid ofFagopyrumtataricumwas stable at pH from three to seven. Several factors weren’t effect on flavonoids including temperature, illumination, K+, Na+, Fe2+, Fe3+and Mg2+. When the concentration of flavonoids was 0.4 g·L-1, scavenging rate of ·DPPH and ·OH respectively were 82.49% and 83.70%. And the reducibility increases with the concentration increase of flavonoids. The results showed that flavonoids of YanmenFagopyrumtataricumhad antioxidant activity.

收稿日期：2016-02-19 修回日期：2016-03-09

作者简介：付丽红(1984-)，女(汉)，山西晋中人，讲师，博士，研究方向：粮油加工

基金项目：山西农业大学博士启动基金(2013YJ32)，校科技创新基金(20142-13)

中图分类号：TS201.4

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)06-0439-06