利用转录组学和蛋白质组学技术揭示小麦抗旱分子机制的研究进展

张红亮，王道文，张正斌

(1.中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心，河北石家庄 050021； 2.中国科学院大学生命科学学院，北京 100049； 3.中国科学院遗传与发育生物学研究所/植物细胞与染色体工程国家重点实验室，北京 100101)



利用转录组学和蛋白质组学技术揭示小麦抗旱分子机制的研究进展

张红亮1,2，王道文3，张正斌1

(1.中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心，河北石家庄 050021； 2.中国科学院大学生命科学学院，北京 100049； 3.中国科学院遗传与发育生物学研究所/植物细胞与染色体工程国家重点实验室，北京 100101)

干旱是影响小麦种植区域分布、产量和品质的最严重的非生物胁迫因素之一。随着气候变暖、淡水资源日益短缺，干旱对小麦的影响呈现加重趋势。当前，转录组和蛋白质组技术已经成为研究小麦抗旱分子机制的常规和可靠工具，利用这两种技术已在不同小麦品种和小麦野生近缘种中鉴定出了大量参与小麦抗旱分子调控网络的基因和蛋白质。本文简要介绍了近年来利用转录组和蛋白质组学技术获得的对小麦响应干旱分子机制的认识，指出了存在的主要问题，并展望了未来发展趋势，对应用已有的研究成果改良小麦抗旱性及进一步应用转录组和蛋白质组学技术更好地揭示小麦抗旱分子机理具有参考意义。

转录组；蛋白质组；小麦；抗旱机制

在过去小麦育种实践中，通常将重点放在产量的提高和品质的改良等方面。近年来，随着气候变暖及淡水资源短缺日益严重，干旱对小麦生产的不良影响呈现加重趋势，对我国乃至世界粮食安全造成严重威胁。因此，阐明小麦抗旱分子机理，培育抗旱小麦新品种，成为亟待解决的问题。在传统的小麦抗旱遗传改良实践中，一般通过不同抗旱能力小麦品种间有性杂交进行抗旱性的改良。这种方式虽然对提高小麦抗旱性起到了很大的推动作用，但存在重要缺陷。一是由于种间生殖隔离的限制，不利于利用小麦近缘或远缘种蕴含的优异基因或QTLs资源对小麦进行抗旱遗传改良；二是通过有性杂交进行抗旱相关基因转移易受不良基因连锁的影响，如要摆脱不良基因连锁的影响则必须对多世代、大规模的遗传分离群体进行检测；三是利用有性杂交转移基因的成功与否一般需要依据表观变异或生物测定来判断，检出效率易受环境因素的影响。上述缺陷在很大程度上限制了常规育种手段在小麦抗旱遗传改良中的应用。

小麦抗旱性是非常复杂的数量性状，涉及很多基因、microRNAs的调控以及激素、离子、代谢物等含量的变化[1]。植物可以感受外部环境胁迫信号(如干旱、高温、盐胁迫等)，对它们作出响应以避免胁迫对其自身造成伤害[2]。同时，植物对胁迫的响应是一个动态变化过程，可划分为不同阶段，即预警阶段、适应阶段和抵抗阶段。当胁迫持续时间很长或胁迫程度很严重时，还会出现衰老死亡阶段。胁迫因子去除后，植物会从胁迫条件下恢复并建立新的动态平衡，即恢复阶段[3-5]。干旱可诱导植物发生三种存在相互作用的变化[6-9]：改变基因的表达(上调、下调、共表达)；改变蛋白质的合成、转运与降解；改变代谢途径，导致代谢物的变化。这些变化综合调控植物对干旱胁迫的抗性。

随着DNA测序和生物信息学等技术的发展，基因组学、转录组学、蛋白质组学、表型组学等组学手段逐步被用于解析植物抗旱分子机制。这类研究的优势在于能够对植物的某一特定器官、组织中的全部基因表达情况或蛋白、代谢物的含量进行准确高效的鉴定，可以从整体了解特定器官或组织对干旱胁迫的响应机制，鉴定出参与干旱信号转导的基因、蛋白、代谢物等。组学数据和传统育种的整合还可以定位新的抗旱数量性状位点(QTLs)，加快植物耐旱性改良进度[10-11]。本文对近年来利用转录组学和蛋白质组学技术对小麦响应干旱分子机制的认识进行了简要介绍，指出了存在的主要问题，并展望了未来发展趋势，为利用组学手段进一步揭示小麦抗旱分子机理提供参考。

1 转录组学技术在小麦抗旱研究中的应用

转录组学是指对某一器官或组织在某种特定条件(如干旱)下其全部RNA转录本丰度的研究，这是目前研究基因组水平变化最常用和最直接的方式。目前进行转录组学分析常用的方式有两种：一是基因芯片(Gene chip)杂交，二是转录组测序(RNA-seq)。基因芯片，又名DNA微列阵(Microarray)，是由大量DNA或寡聚核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其基本原理是通过杂交检测信号，可以实现基因转录信息的大规模检测[12-13]。

Xue等[14]利用包含大约16 000条小麦表达序列标签(ESTs)的基因芯片筛选高蒸腾效率和低蒸腾效率基因型杂交后代中差异表达基因，共发现93个在高、低蒸腾效率的株系间表达有差异的基因，其中五分之一显著响应干旱胁迫；与生长相关的部分调节基因，在干旱胁迫时下调表达。此外，这些基因在高蒸腾效率的株系中表达量显著高于低蒸腾效率株系，推测这些基因可能与高蒸腾效率株系生物量的产生有关。Mohammadi等[15]利用寡聚核苷酸芯片从一个耐干旱普通小麦品种中分析根响应水分胁迫的转录组变化，发现大部分受脱水诱导的基因(如编码渗透保护剂、水溶性物质、蛋白酶、糖基转移酶/水解酶、信号转导组分等蛋白的基因)与先前报道的其他物种在渗透胁迫条件下表现相似；与天冬酰胺、海藻糖、寡肽转运蛋白、离子结合蛋白、γ-氨基丁酸合成有关的基因上调表达；与谷胱甘肽、硫和部分氨基酸代谢相关的基因下调表达。此外，还发现了一个新的受脱水诱导的AP2/ERF类型转录因子，预测其是一个转录抑制子。Xue等[16]用cDNA芯片研究干旱条件下普通小麦叶片中参与碳水化合物代谢的基因表达变化情况，发现在长时间干旱胁迫处理下，参与卡尔文循环的大多数叶绿体中酶的编码基因表达量显著下调，但胞质和液泡中参与葡萄糖、果糖和果聚糖合成酶基因在胁迫处理的叶片中上调表达。进一步分析表明，参与碳固定、己糖和果聚糖积累的关键酶基因协同调控碳水化合物的代谢，这对于小麦适应干旱胁迫至关重要。Mohammadi等[17]利用包含大约17 000条寡聚核苷酸探针的芯片研究小麦品种“Opata”根响应水分胁迫的转录组变化，结果共鉴定出394个变化超过1.5倍的转录本，其中，190个转录本上调表达，204个下调表达。同时，发现多个编码葡聚糖酶和类型III过氧化物酶的基因显著响应水分胁迫。Secěnji等[18]用cDNA芯片对两个水分利用效率不同且均经为期4周的中度水分胁迫的普通小麦品种 Plainsman V(耐旱)和 Kobomugi(旱敏感)分蘖期根部进行了转录组学分析，结果发现，Plainsman V有773个转录本上调和879个转录本下调，Kobomugi有448个转录本上调和507个转录本下调，其中，在两个材料中均上调表达的转录本有207个，均下调表达的转录本有205个；差异表达基因的功能主要集中在运输、蛋白质代谢、渗透保护物质合成、细胞壁合成等方面，氧化还原酶、过氧化物酶和细胞壁相关的基因仅在Plainsman V中差异表达，与胁迫和防御相关的基因在Kobomugi中诱导表达更加明显。Naydenov等[19]对普通小麦中国春吸胀作用后萌发的胚胎用0.3 mol·L-1甘露醇处理3 d，研究其线粒体转录组的变化，共发现23个差异表达基因，其中，cob、ccmFn、MnSOD和AOX上调表达， nad6、 atp4和 atp9下调表达。

Affymetrix商用化小麦芯片(Wheat Affymetrix GeneChip@)的问世，使得以芯片为工具进行小麦干旱胁迫下转录组学研究更加普遍。 该芯片包含61 127个探针组，覆盖了小麦42条染色体的55 052个转录本。序列信息来源于GenBank和EST数据库。迄今为止，已经有很多用小麦基因组芯片进行小麦响应干旱胁迫转录组变化的研究。Li 等[20]对耐旱小麦品种洛旱2号和干旱敏感品种中国春幼苗根部经20% PEG6000处理6 h后的转录组变化进行分析，发现洛旱2号有1 593个转录本上调，2 238个转录本下调；中国春有1 404个转录本上调，1 493个转录本下调；在两个品种中均上调的转录本有569个，均下调的有424个。对差异表达基因进行GO富集分析，发现与非生物胁迫刺激、有机酸合成、脂代谢等相关的生物学过程显著富集。Alessio 等[21]对低水分利用效率硬粒小麦品种Ofanto和高水分利用效率硬粒小麦品种Cappelli在孕穗期停止灌溉至土壤含水量降至12.5%，对叶片进行转录组分析，在Ofanto叶片中鉴定出707个差异表达基因；在Cappelli中鉴定出248个差异表达基因；在两个品种中均存在的差异表达基因有44个。进一步分析发现，干旱诱导了Ofanto中很多已知的与干旱相关的基因表达，而Cappelli能够持续表达几个在Ofanto中受干旱诱导表达的基因。Dante 等[22]对一个普通小麦品种和其衍生的长穗偃麦草7DL易位系在抽穗前期开始干旱处理，发现部分与根发育相关的基因在对照株系和易位系间差异表达，如侧根发育负调节基因 KNAT3、 E2F和 SERK1等，这可以解释易位系具有更强的水分胁迫适应性和更高的根、叶片生物量。Tamar 等[23]对耐旱野生二粒小麦品种Y12-3和干旱敏感品种A24-39在花序出现期停止浇水8 d，分析其旗叶转录组变化，在Y12-3中有3 184个转录本上调，1 478个转录本下调；在A24-39中有1 688个转录本上调，1 738个转录本下调；其中1 336个转录本在两个品种中均上调，860个均下调。对差异表达基因进行GO富集分析，发现多种与调控和信号转导相关的生物学过程显著富集，特别是在Y12-3中。Srirama 等[24]对处于灌浆期的硬红冬麦品种TAM111和TAM112在干旱条件下旗叶转录组变化进行分析，在TAM111发现2 131个差异表达基因，在TAM112中发现3 197个差异表达基因，两个品种共有的差异表达基因数目为1 657个。进一步分析发现，两个品种间与光合、碳水化合物代谢、激素代谢和其他脱水响应相关的转录本受到差异调控。Dimah 等[25]对耐旱硬质小麦品种 Cham1和干旱敏感硬质小麦品种Lahn及以两者为亲本的重组自交系RIL2219在开花期进行干旱处理，分析旗叶转录组变化，发现在3个材料间差异表达基因数目和表达模式各不相同，参与调控的差异表达基因数目较多。Aprile 等[26]对中国春及其缺失系5AL-10和硬质小麦品种Creso在开花期进行中度和重度干旱处理，分析其颖片和旗叶转录组变化，发现共有3 056个差异表达基因。与中国春相比，一些干旱响应基因在Creso和5AL-10缺失系中的表达量低甚至不表达，说明3种基因型小麦不同的基因组结构可能影响植物对胁迫的适应能力。Ergen等[27]对耐旱野生二粒小麦品种TR39477和干旱敏感野生二粒小麦品种TTD-22苗期叶片与根在干旱条件下转录组变化进行分析，发现共有9 587个转录本差异表达。依赖ABA的转录因子基因在耐旱材料中的诱导比在旱敏感材料更为迅速。此外还发现在普通小麦形成过程中，根组织中部分响应脱水的基因网络可能发生了缺失。

小麦基因组庞大而复杂，缺少精细的基因组图谱，限制了利用RNA-seq研究小麦对干旱的分子调控机制。目前，只有少数利用该技术探究小麦在干旱胁迫条件下转录组学变化的报道。Liu等[28]利用该技术对普通小麦品种TAM107苗期叶片在20% PEG6000干旱胁迫、40 ℃高温热胁迫以及二者共同胁迫分别处理1 h和6 h后的转录组变化情况进行了分析，结果表明，有上千个基因响应以上3种胁迫，其中部分基因受2种或3种胁迫的共同诱导；从109 786个基因中鉴定出4 375个编码转录因子的基因，其中，1 328个响应胁迫处理；对以热激转录因子(HSFs)和脱水响应元件结合蛋白(DREBs)为中心的调控网络分析，发现它们同时参与3种胁迫的调控，这表明小麦对热胁迫和干旱胁迫的响应存在交叉途径；利用高通量RNA-seq获得的数据，结合IWGSC数据库中根据小麦染色体信息鉴定出的同源SNPs，实现了对来自小麦A、B、D三个亚基因组同源基因的区分与表达水平的定量分析。发现约68.4%来自A、B、D亚基因组的同源基因均参与了对干旱胁迫、热胁迫或2种组合胁迫的响应，并且位于亚基因组上的三个同源基因受胁迫诱导后表达模式不同。这可以在一定程度解释普通小麦比四倍体小麦具有更强适应能力及更广泛分布范围。为进一步验证该结果，用特异性引物qRT-PCR方法检测了9个受胁迫诱导的差异表达基因在缺体四体系中的表达情况，用于说明进行qRT-PCR的引物可有效区分来自A、B、D亚基因组的同源基因，qRT-PCR获得的A、B、D亚基因组上的同源基因表达结果与RNA-seq数据相一致。

2 转录组学研究小麦抗旱的不足与未来研究重点

不同转录组学研究选取的器官、组织不同，处理方式、胁迫起始和持续时间以及胁迫程度各不相同，因此获得的结果存在很大差异。相当多的研究使用高分子量糖类，例如由聚乙二醇(PEG6000、PEG8000)、 甘露糖(Mannose)等配成的不同浓度溶液，在室内模拟干旱胁迫。尽管这些处理均能降低植物组织水势，但其对植物转录组的影响与田间自然干旱有很大不同。一项研究分别使用滤纸、甘露醇以及低水分含量土壤三种不同方式降低植物组织水势，同时进行三个独立的芯片杂交实验，发现三种处理方式诱导的差异表达基因中仅有1%是共同的[29]。

以实现在最适生长环境下获得最高产量为目的的驯化和人工选择导致了现代栽培小麦品种遗传多样性减少，对环境胁迫耐受性也逐步降低[30]。而一些小麦祖先种如野生二粒小麦、粗山羊草等保留了进化适应的特性，具有很强的抗旱能力[31-34]。因此，充分挖掘、利用这些野生种质资源中的优异基因或QTLs，并通过传统杂交育种、分子标记辅助育种、转基因等方式导入到现代小麦品种中，将有助于提高现代小麦品种的遗传多样性，有效改良小麦的抗旱能力[31]。此外，与普通小麦相比，小麦祖先种倍性较低，基因组相对较小和简单，进行转录组学分析也较为容易。当前运用基因芯片杂交或RNA-seq技术研究小麦野生近缘种在干旱胁迫下的转录组学研究较少，未来应加强运用这些手段解析野生种质资源耐干旱的分子机理，以便发现在普通小麦人工驯化和现代育种进程中丢失的耐旱基因及优异等位变异。

当前的研究利用比较转录组学方式居多，如比较对照组和处理组在干旱胁迫条件下转录组差异，耐旱性不同的两种或多种基因型对干旱胁迫转录组响应的差异，来筛选和鉴定与胁迫相关的基因或者生物学过程、代谢通路等。由于小麦抗旱机制的复杂性和转录组学的高通量，几乎每个研究都能筛选到成百上千的差异表达基因。但是目前对筛选出的差异表达基因进行后续功能验证的研究很少。因此，构建基因共表达调控网络，从众多候选基因中选取关键调控基因，进行功能验证并应用于育种实践可能成为今后研究的重点内容。

选择性剪切(可变剪切)是指一个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪切位点组合)产生不同mRNA分子的过程。选择性剪切和RNA加工属于转录后调控的一部分，能够影响mRNA的稳定性，改变编码蛋白的含量、活性和稳定性。干旱胁迫可以通过改变剪切因子蛋白如富含丝氨酸/精氨酸的剪切因子或多聚嘧啶序列结合蛋白的表达和剪切模式控制其他基因的剪切[35-36]。已有证据表明RNA结合/稳定蛋白能够提高植物的抗旱性[37]。目前，有关选择性剪切对植物转录组和蛋白质组的影响以及在干旱胁迫下如何变化的研究仍处于起步阶段。脯氨酸是一种重要的渗透调节剂，植物在受到干旱胁迫时会大量积累脯氨酸。脯氨酸合成的关键酶是Δ1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶，催化脯氨酸合成的第一步反应，该酶由 P5CS1基因编码。 P5CS1基因mRNA前体的选择性剪切能够影响Δ1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶含量，有助于植物适应不同的气候[38]。目前也发现其他一些与干旱有关的基因也存在选择性剪切。当然，还有很多尚未发现的存在选择性剪切的潜在基因。例如，编码小麦脱水响应元件结合蛋白的 DREB2基因有三种转录本类型，其中两种受到干旱或盐胁迫的差异调控[39]。因此，系统研究在干旱胁迫下剪切因子的表达及其如何影响转录谱和最终植物的表型可能会成为今后在转录水平上研究小麦应对干旱胁迫的一个重要内容。

3 蛋白质组学在小麦抗旱研究中的应用

蛋白质是生命活动的主要承担者，直接参与了干旱胁迫相关的众多生物学过程[40]。蛋白质组指由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质[41-42]。蛋白质组学本质上指的是大规模研究蛋白质的特征，包括蛋白质表达水平、翻译后修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得在蛋白质水平上对于目标性状整体而全面的认识。由于可变剪切、RNA编辑、蛋白翻译后修饰的存在，许多基因可以表达出多种不同的蛋白质。对于一个物种来说，其蛋白质数目可能会多于其基因数目[41, 43]。因此，蛋白质组的复杂度要比基因组的复杂度高得多。与转录组学数据相比，蛋白质组数据与表型关系更为紧密[2, 44]。

普通小麦是异源六倍体，基因组大而且复杂，重复序列多。因而从蛋白质组出发研究小麦的抗旱反应机制是一个很好的入手点。在过去的20年间，随着蛋白质分离和相对定量技术(如2D-DIGE、iTRAQ和MS/MS)的进步，高通量蛋白质组学技术被越来越多地用于揭示小麦抗旱反应的分子网络调控机制。Hajheidari等[45]研究了普通小麦春麦品种Arvand、Kelk、Khazar和Afghai籽粒在干旱胁迫下蛋白质组的变化，结果发现，共有121个蛋白上调表达，主要包括硫氧还蛋白(Trx)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、蛋白二硫键异构酶(PDI)、胚胎后期丰富蛋白(LEA)、过氧化物氧还蛋白(1-Cysperoxiredoxin)、热激蛋白(sHSP17和HSP70)等，其中57个得到鉴定。Ford等[46]对澳大利亚小麦干旱敏感品种(S) Kukri和耐旱性品种(T) Excalibur、RAC875叶片在干旱条件下蛋白质组的变化进行了研究，结果共鉴定出1 299个蛋白，其中与活性氧代谢相关的蛋白水平上升，与光合和卡尔文循环相关蛋白水平下降。此外，该研究还发现脱水素(COR410)在耐旱基因型中上升幅度高于干旱敏感基因型。Alvarez等[47]对普通小麦品种Nesser(T)和Opata M85(S)根在干旱和ABA处理条件下蛋白质组的变化进行了研究，结果共鉴定出1 656个蛋白，其中805个ABA响应蛋白，包括LEA、蛋白磷酸酶PP2C等；HSP70、HSP90、G蛋白、V型ATP酶在耐旱基因型小麦中含量更高；β-细胞壁松弛蛋白、膜孔蛋白在干旱敏感基因型含量更高。Caruso等[48]研究了硬粒小麦品种Ofanto叶片响应干旱胁迫的蛋白质组变化，结果共鉴定出36个蛋白，上调表达的有碳酸酐酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)大亚基；下调表达的有Rubisco小亚基、ATP合成酶等。Budak等[49]对硬粒小麦品种Kiziltan(S)和野生二粒小麦系TR3947、TTD22(T) 叶片在持续9 d不浇水的条件下蛋白质组变化进行了研究，结果共鉴定出75个蛋白，其中11个候选蛋白与耐旱性相关；磷酸丙糖异构酶(TPI)、ATP合成酶CF1在耐受基因型小麦中含量更高；β-1, 3-葡聚糖酶、β-1, 4-葡聚糖酶、木葡聚糖转移酶(XET)、甲硫氨酸合成酶在干旱敏感基因型含量更高。Kang等[50]对普通小麦Yumai 34叶片在15% PEG处理条件下蛋白质组变化进行了研究，结果发现82个差异蛋白，其中76个得到鉴定，上调的蛋白主要有14-3-3、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和GST等。Ye等[51]对普通小麦春麦品种Abbondanza(T)、Qingchun 38(S)在PEG6000处理下蛋白质组的变化进行了研究，结果共发现38个差异蛋白，其中35个得到鉴定，上调的蛋白有甘油醛-3-磷酸脱氢酶、26S蛋白酶体、V型ATP酶A等，下调蛋白有Rubisco大小亚基、TPI、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)等。Zhang等[52]对普通小麦品种旱选10号(T)、宁春47(S)苗期叶片在20% PEG6000处理48 h后蛋白质组的变化进行了研究，分别鉴定出173个(T)和251个(S)磷酸化蛋白，包括信号转导组分(SnRK2 激酶、PP2C、细胞周期蛋白和钙调蛋白2-2)、转运蛋白(AQP、MSSP2和H+-ATPase)和胚胎后期丰富蛋白(WCOR719、WCOR825和WRAB17)等。Hao等[53]对普通小麦品种旱选10号(T)、中国春(S)的苗期叶片、根及根叶中间部分在20% PEG6000分别处理6、12、 24、48 h和恢复48 h后的蛋白质组变化进行了研究，在根中鉴定出122个差异表达蛋白，在叶片中鉴定出163个差异表达蛋白，在根叶中间部分鉴定出146个差异表达蛋白。其中，在根和根叶中间部分鉴定的蛋白主要与细胞防御和脱毒有关。在叶片中，3个与光合作用相关的蛋白含量呈显著变化，它们分别是Rubisco大亚基、oxygen evolving enhancer protein 2(OEE2)和Rubisco活化酶。经干旱处理后，旱选10号的Rubisco大亚基和Rubisco活化酶表达显著上调，而在中国春中这两个蛋白表达下调或不能被检测到。干旱解除后，旱选10号中Rubisco大亚基和Rubisco活化酶表达下调，而OEE2表达上调将近4倍；耐旱基因型旱选10号中与胁迫防御相关的差异表达蛋白数目远高于干旱敏感型；6个与干旱耐性相关的热激蛋白在干旱条件下显著上调，旱选10号中HSP60、HSP90等磷酸化水平在干旱胁迫下上升。Peng等[54]对体细胞杂交小麦Shanrong 3及其亲本面包小麦品种Jinan 177苗期叶片和根在18% PEG6000处理24 h后的蛋白质组变化进行了研究，结果分别鉴定出93个(根)和65个(叶)差异表达蛋白；Shanrong 3品种耐旱性的提升主要是由于其对渗透和离子稳态的调控能力增强，具有有效清除有毒副产物的能力和更好的恢复生长潜力。Demirevska等[55]对4个田间抗旱能力不同的冬小麦品种Katya、Sadovo、Zlatitza和Miziya在停止浇水7 d和恢复浇水3 d后的蛋白质组变化进行了研究，结果发现经7 d干旱后，水分恢复3 d不能使Rubisco大亚基含量恢复至对照水平，特别是对干旱敏感品种Miziya。Kamal等[56]观察了普通小麦品种 Keumganag 10 d幼苗停止浇水9 d后蛋白质组的变化，结果发现9个蛋白上调表达，16个蛋白下调表达，11个蛋白不受影响。其中，Rubisco大小亚基、氯离子通道蛋白家族、H+-ATP酶上调；膜蛋白ATP合成酶b亚基和细胞色素b6-f复合体下调表达。Horvath等[57]对普通小麦春麦品种CY-45和其转基因系T-117、 T-106-3/a、T-128苗期叶片经干旱处理后蛋白质组的变化进行了研究，结果发现受干旱诱导的蛋白分子量集中在15～27 kDa，pH值为6.5～7.5；受胁迫的转基因株系中存在一些类抑制剂蛋白，如α-淀粉酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂CM1前体等，这可以解释转基因系干旱敏感表型。Jiang等[58]对普通小麦品种Kauz(T)和Janz(S)经干旱处理后蛋白质组的变化进行了研究，结果发现153个差异表达蛋白，其中122个得到鉴定，这些蛋白主要参与碳水化合物代谢、脱毒、防御和储藏；两个品种间一些关键蛋白表达模式显著不同，如过氧化氢酶同工酶1、LEA、α-淀粉酶等。从上面的研究结果中，可以看出以下几点。

(1) 不同蛋白质组学研究选取的小麦品种、器官、组织不同，处理方式、胁迫起始和持续时间以及胁迫程度也各不相同，导致鉴定的差异蛋白种类和数目有很大差异。

(2) 受干旱胁迫诱导的蛋白按功能主要可分为以下几类：a.参与干旱胁迫信号转导，如蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK2)、蛋白磷酸酶2C(PP2C)等；b.参与代谢途径，如参与光合作用的Rubisco大小亚基和细胞色素b6-f复合体；c.具有脱毒、防御和储藏功能的蛋白，如LEA、HSP等。

(3)耐旱性不同的基因型间差异表达蛋白数目和种类均有所差异。而蛋白种类的差异可能比数目的差异在决定抗旱能力强弱上发挥着更为重要的作用。同时，一些重要蛋白表达模式的差异也是造成基因型间耐旱性不同的重要原因。

(4) 大部分研究都是基于比较蛋白质组学方法，发现耐旱能力显著差异的基因型之间在蛋白表达种类和水平等方面的不同，进而推测他们抗旱性差异的分子机理。

4 蛋白质组学在小麦抗旱研究中的不足与未来研究重点

(1)虽然利用蛋白质组学获得了大量有关小麦在干旱条件下积累各种保护蛋白和调整细胞代谢的信息。然而，对于一些低表达量的调控蛋白，如参与胁迫信号转导和基因表达调控的蛋白还知之甚少。这些蛋白在干旱胁迫初期的胁迫信号转导过程中发挥重要作用。

(2)尽管从植物样品中鉴定出了上千种蛋白，但针对某一特定组织、发育阶段和环境条件下植物蛋白质组的完全揭示仍然是一个巨大的挑战[59]。另外，随着蛋白质组数据的日益增多，从众多数据中挖掘关键蛋白，开发耐旱蛋白标记应用于小麦抗旱品种选育已成为一项紧迫的任务。

(3)蛋白质翻译后修饰在调控蛋白功能方面发挥着重要作用。磷酸化和去磷酸化是一种常见的蛋白质翻译后修饰形式，一些参与胁迫信号转导的酶的活性受到磷酸化和去磷酸化的调控，进而启动或关闭胁迫信号转导通路。当前多数基于比较蛋白质组方法的研究集中在某一植物组织(或者某一特定的亚细胞组分，如细胞核、线粒体、质体)蛋白质含量的变化，而对其翻译后修饰、蛋白之间相互作用研究较少。随着研究逐步深入，对胁迫条件下植物蛋白质组的研究可能会逐步向翻译后修饰方向倾斜。开展磷酸化蛋白质组、氧化还原蛋白质组、蛋白互作等研究有助于全面揭示蛋白的功能，帮助我们更好地理解植物对环境胁迫的适应和胁迫耐性的获得。

5 蛋白质组和转录组的联系与差异

按中心法则所述，基因表达的主要环节包括转录和蛋白质合成。理论上讲，从生长条件和状态相同的细胞、组织或器官获得的转录组与蛋白质组数据之间应该具有较高的相关性。Koh等[60]对油菜在干旱胁迫下20个基因在转录和蛋白质水平进行比较，发现尽管有些基因的转录本和蛋白的表达模式不尽相同，二者之间仍存在显著正相关。胁迫时间越长，相关性越明显，因此在干旱胁迫条件下，大多数蛋白丰度的改变是由于基因转录水平的变化造成的，而翻译后修饰丰富了蛋白的多样性和功能。Budak等[49]对硬粒小麦品种Kiziltan和野生二粒小麦系TR39477、TTD22(T)进行干旱胁迫条件下蛋白质组学分析，同时挑选RuBisCO、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、GST和铁氧还蛋白-NADP还原酶(FNR)四个蛋白对其mRNA用qRT-PCR定量，发现在有些品种和胁迫条件下，转录本的变化和蛋白水平的变化一致，但也有部分转录本的变化和蛋白水平的变化趋势相反。比如，RuBisCO转录本在干旱胁迫处理下的三种基因型中均显著下调，但其蛋白含量均上升。GST的mRNA水平在干旱处理的Kiziltan和TTD22基因型中上升，与其蛋白水平的上升一致。然而，在TR39477中则呈现相反的趋势，转录本水平下降，蛋白水平上升。Peng等[54]对体细胞杂交小麦品种Shanrong 3及其亲本面包小麦品种Jinan 177 苗期叶片和根用18% PEG6000模拟干旱胁迫进行蛋白质组学分析，同时用cDNA芯片进行转录组学分析，发现仅有20个(27.0%)差异表达蛋白在转录本与蛋白水平有相关性，但整体来看，蛋白质组和转录组之间的相关性并不强。

上述研究中观察到的转录本与其蛋白水平不一致的原因可能包括以下两点：1、基因的表达一般受到转录和翻译两个层面的调控，而每一个层面的调控又有多种方式，使得基因表达调控机制变得非常复杂。2、因为检测的时间点不同，可能在蛋白达到峰值的时候mRNA已经降解或者在mRNA达到峰值的时候蛋白含量还在变化中。因此，将转录组数据和蛋白质组数据结合起来分析，才可能有助于更加全面和深入地了解控制植物响应干旱胁迫的分子机理。

6 研究展望

利用转录组学和蛋白质组学技术已在小麦中鉴定出一些响应干旱胁迫的基因和蛋白质，如参与干旱信号转导的HSFs、DREBs、 TaWRKY16、 (〗TaWRKY17、 TaWRKY24、 TaWRKY19-C、 TaWRKY59、)〗 TaWRKY82、 TaWLIP19、 TaNAC69、 TaMYB33等调控基因；脱水素、胚胎后期丰富蛋白、水通道蛋白、热激蛋白、抗氧化剂等起防御作用的功能蛋白。这些基因和蛋白质很多已被证实参与了小麦抗旱分子调控网络。这些信息有助于更加全面系统地揭示小麦复杂的抗旱机理。

小麦基因组庞大而复杂，过去由于缺少必要的基因组信息，限制了利用转录组学、蛋白质组学手段对其干旱胁迫响应机制的研究。2013年以来，六倍体普通小麦及其二倍体祖先物种乌拉尔图小麦(Triticumurartu)和粗山羊草(Aegilopstauschii)基因组草图的相继发表[61-65]，为小麦遗传学和基因组学研究提供了比较全面和准确的参考基因组序列。由于小麦抗旱机制复杂性，转录组学和蛋白质组学研究通常能发现成百上千差异表达基因或蛋白质。过去研究的思路是通过生物信息学手段进行GO和KEGG富集分析等，发现与胁迫相关的生物学过程、代谢通路等，这部分研究对系统认识小麦抗旱机制发挥了重要作用。同时，由于先前小麦遗传转化较为困难，通过转基因方式等分子手段揭示鉴定出的某一基因或蛋白发挥抗旱功能的研究比较少。随着小麦遗传转化体系的不断优化、基因组编辑技术的兴起等技术手段不断进步，也为鉴定出的候选基因和蛋白的功能验证提供了便利条件。同时，蛋白分离及定量技术也在不断完善。可以预见，转录组学、蛋白质组学手段将在小麦抗旱研究中得到进一步应用，为全面和深入揭示小麦抗旱调控分子网络做出重要贡献。

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Progress and Prospects in the Research on Wheat Drought Response and Resistance Mechanisms Using Transcriptomic and Proteomic Approaches

ZHANG Hongliang1,2, WANG Daowen3, ZHANG Zhengbin1

(1.Center of Agricultural Resources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences,Shijiazhuang, Hebei 050021, China; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;3.State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

Drought is one of the most serious abiotic stresses negatively affecting wheat distribution, yield and quality. With the exacerbation of global warming and the growing shortage of fresh water, the adverse effects of drought on wheat production are becoming more and more severe. Currently, the transcriptomic and proteomic approaches have become common and reliable tools in studying the mechanisms of wheat resistance to drought and many genes and proteins involved in the molecular regulatory networks of wheat response and resistance to drought have been identified in different wheat varieties and its wild relatives. This paper briefly reviews the main general findings in the research on the molecular mechanisms underlying wheat response and resistance to drought using transcriptomic and proteomic approaches. The limitations of current research and the tendency of such studies in the future are also discussed，which may be helpful to utilize the existed research findings for the improvement of wheat drought resistance and may aid more effective investigations of the mechanisms involved in wheat response and resistance to drought stress by using transcriptomic and proteomic approaches.

Transcriptome; Proteome; Wheat; Drought response and resistance mechanism

时间：2016-07-07

2016-03-03

2016-04-15

中国科学院战略先导科技专项(A类)(XD080310703)

E-mail：hongliangzhang@genetics.ac.cn

张正斌(E-mail:zzb@sjziam.ac.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)07-0878-10

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1530.016.html