广州市2009－2010年DENV－3型病毒分子生物学特征分析

梁雪莹 景钦隆 李意兰 曹 庆 魏跃红 罗 雷

广州市2009－2010年DENV－3型病毒分子生物学特征分析

梁雪莹 景钦隆 李意兰 曹 庆 魏跃红 罗 雷

目的探讨广州市DENV－3型病毒的基因变异及传播模式，为登革热疫情防控提供科学建议。方法对2009－2010年采集的疑似登革热病例早期血标本进行检测RT－PCR，阳性标本血清接种至C6/36细胞进行病毒分离培养。对登革病毒E基因进行测序，并与基因库中全球和中国其他省份DENV－3代表病毒株进行比对，对广州病毒分离株的来源和同源性进行分析。结果共分离获得13份DENV－3型病毒样本(2009年7份，2010年6 份)，基因树系谱分析显示DENV－3型病毒包括3个基因型(Ⅰ，Ⅲ，Ⅴ)，其中基因Ⅰ型来源于印度尼西亚，基因Ⅲ型的2个节点族中，A节点族来源于科特迪瓦，B节点族来源于坦桑尼亚，基因型Ⅴ来源于菲律宾。2009年和2010年病毒株E基因核酸分别存在1.3%～9.0%和0.5%～3.9%的差异。结论2010年分离病毒株并非2009年的延续，不同基因型的DENV－3型病毒可能是通过不同的地理路径传入。

登革热;DENV－3型;分子生物学

【Author's address】Guangzhou Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 510440，China

登革病毒(Dengue Virus)是黄病毒属中的一个血清型亚群，形态结构与乙脑病毒相似，体积约17～25 nm，依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型，同一型中不同毒株也有抗原差异［1］。感染登革病毒后可引发不同的临床表现［2］，重症者甚至出现登革出血热或登革休克综合症［3－4］。1980年广州市范围内首次分离出DENV－3型病毒，随后四型登革热在广州相继出现，2000年后，广州登革热暴发多由DENV－1引起。但DENV－3型在2009和2010年再次被分离出，且引发了较大规模的暴发流行［5］。连续两年同型登革病毒的流行提示广州可能存在本地化的风险，而现场流行病学调查无法证实上述风险。因此，为探明DENV－3型病毒在广州流行的分子生物学特征判断两年同一血清型登革病毒暴发疫情是否由同一基因型别引起，特对2009年和2010年所获得的DENV－3型病毒E基因全序列进行全面的分析。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 病例及标本采集

2009－2010年间通过主动和被动监测累计诊断登革热病例55例，每例病例均采集急性期外周血5 mL，6 h内送实验室进行登革病毒实验室检测。

1．2 病毒株获取

阳性血标本1∶10稀释后取100 μL接种C6/36白蚊伊蚊传代细胞，吸附1 h后弃去上清，加入含15%小牛血清的RPMI1640培养基，置34℃孵箱中培养，7 d后传代，以出现细胞病变为阳性，连续传代3次均无细胞病变则判断为阴性。在细胞病变达+++时取细胞培养液上清，－70℃冻存［6］。

1．3 RNA提取和扩增

取病变细胞培养上清140 μL，用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取登革病毒RNA。用PrimeScript One－Step RT－PCR(TaKaRa)试剂盒进行RT－PCR反应，反应条件如下:50℃ 30 min逆转录，94℃2 min变性，94℃30 s，55℃30 s，72℃3 min，35个循环，最后72℃保温7 min。用TBE缓冲液配制含0.5 μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，取5 μL PCR产物，与1 μL上样缓冲液混和，在TBE缓冲液中以80 V恒压电泳1 h，在透射式紫外分析仪上观察，出现特异性条带为阳性。

1．4 E基因序列测定与同源性分析

扩增的DENV－3型病毒DNA经纯化后采用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Germany)进行序列测定。测定后的各片段序列采用Seqman II程序(DNASTAR，Inc．，Madison，WI，USA)进行拼接并组装成完整的E基因组序列，经过核对校正后上传至GenBank。序列测定所用引物见表1。采用BLAST引擎对核苷酸百分比和氨基酸一致性进行同源性比对;应用Clustal X v．1.83软件进行序列多重比对，然后运用MEGA 4.0软件采用Kimura校正模型的领接法(neighbor－joining，NJ)构建系统发育树［7］。

表1 用于DENV－3 E基因全序列扩增和测序引物

2 结果

2．1 分离获得病毒株情况

55例病例中17份标本RT－PCR检测阳性，共分离获得13株DENV－3病毒，其中2009年7株，2010年6株，病毒株 E基因序列均上传至 Gen-Bank，各病毒株基本信息及上传序列号，见表2。

表2 广州2009－2010年13株DENV－3病毒分离株基本信息

2．2 核苷酸和氨基酸序列比较

除10/GZ/10549病毒株外，2010年的其余5株DENV－3分离株非常近似，核苷酸和氨基酸一致性分别为99．5%～100%与98．7%～100%。2009年3株分离株(09/GZ/1483，09/GZ/10806，09/GZ/ 1081)表现出高度一致，核苷酸和氨基酸一致性均超过 99．7%。2009年其余 3株病毒(09/GZ/ 10616，09/GZ/11144，09/GZ/11194)与 09/GZ/ 13105分离株相似度较低(核苷酸一致性在99．3%～99．5%之间，氨基酸一致性在98．9% ～99．1%之间)。然而，2009年与2010年病毒分离株核苷酸和氨基酸差异分别在1．3% ～9．0%和0．5%～3．9%之间，提示两年分离获取的13株DENV－3可能来自不同的地区。13株DENV－3病毒E基因核苷酸百分比和氨基酸一致性见表3。

2．3 基因序列进化分析

从GenBank检索出90株代表全球不同地区DENV－3病毒E基因序列(表4)，与广州2009年和2010年的13株DENV－3病毒E基因序列绘制系统发生树(见图1)，结果显示广州13株DENV－3病毒株分属DENV－3型病毒的I、III和V基因亚型，其中2010年仅1株分离(10/GZ/10549)属于I基因亚型，与2004至2007年印度尼西亚分离株相近似，3株2009年分离(09/GZ/1081，09/GZ/1483，和09/GZ/10806)属于V基因亚型，这与广西1980年分离株近似。其余9株病毒均分属III基因亚型，且可分为A和B两个节点族，A节点族包括2009 年 4株 (09/GZ/11144，09/GZ/11194，09/GZ/ 10616和09/GZ/13105)，B节点族包括2010年5株分离株(10/GZ/4898，10/GZ/5536，10/GZ/9119，10/GZ/9534，和10/GZ/9721)，这些毒株系统发生树与2010年坦桑尼亚分离株相近似。

表3 2009－2010年广州13株DENV－3病毒株间核苷酸和氨基酸一致性百分比

表4 用于E基因测序分析的DENV－3病毒参考株

3 讨论

DENV－3病毒最初在1956年菲律宾暴发疫情中分离到［8］，之后该血清型迅速地扩散至全球各地。截止目前，DENV－3可分为4～5个基因亚型。I～III基因亚型是DENV－3感染的主要基因型，且与东南亚、印度次大陆、东非和美洲的DF/DHF发生有关。DENV－3病毒中的III基因亚型被认为可能具有更强的传播效率［9］，甚至更易导致登革出血热的发生，一旦该基因亚型在局部地区形成传播流行，其很快将导致跨区域的大流行［10］。

广州近10年均为DENV－1流行，2009年和2010年流行的DENV－3是距1980年29年之后的再现［3］，系统发生树分析结果显示2009年和2010年虽然均分离到III基因亚型病毒株，但两年的病毒株却分属两个不同的节点族(节点A和节点B)，两者之间的病毒株核苷酸的一致性相对较低(97.7%～98.7%)，尚不能证明两年之间的流行存在关联。相反，广州市分离到的病毒株与境外发现病毒株存在高度同源性:A节点族与2008年科特迪瓦分离株更相近，2010年5株病毒与坦桑尼亚2010年分离株AB549332共同组成B节点族，提示两年的DENV－3型病毒可能来源于不同的国家或地区，DENV－3病毒可能存在多条输入途径进入广州，既往研究显示2010年3株白云区分离株，1株南沙区分离株和1株越秀区分离株与坦桑尼亚2010年分离株近似，而2010年番禺区分离株印度尼西亚病毒株相近似［5，6，10］。随着国际旅游和对外贸易的发展，登革病毒跨国传播风险也急剧增加。因此，在今后的防控工作中，应在机场等出入境关口建立切实有效的发热病例筛检系统及时发现可疑输入性病例以及加强登革病毒的实验室监测以及时发现早期输入病例［11］。输入病例进入广州后未得到有效控制是境外基因亚型DENV－3病毒在广州流行的重要原因，因此病例监测系统的灵敏性和输入病例控制的能力也亟待提高。

综上所述，2009和2010年广州登革疫情并非同一流行株的连续传播或2009年毒株在2010年的再现，不同基因型的DENV－3型病毒可通过不同的地理路径传入，DENV－3不同基因亚型毒株的反复输入是引发广州2009年和2010年登革热暴发流行的主要因素，分子流行病学研究提示DENV－3在广州的再现流行尚未表现出本地化的趋势。虽然对获取到的所有病毒株进行了同源性分析，但由于仅有13份病毒株，本研究的结论仍需大样本的验证，在今后的研究中，将继续加强广州登革热病例监测和登革病毒分离培养工作，进一步探讨输入病例在本地的传播模式，同时验证登革热是否存在本地化的趋势。

［1］ 张守平，汪 明．登革热研究进展［J］．中国兽医杂志，2012，48 (10):61－63．

［2］ 方 明，麦柏坚，萧翠萍．发热并白细胞计数正常或减少238例临床分析［J］．现代医院，2014，14(8):46－50．

［3］ 潘越峻，张 媛，邓西龙．重症登革热合并肺部改变患者临床特征分析［J］现代医院，2016，16(4):501－503．

［4］ 王天舒，杨兰清，卢海清．重症登革热患者炎症因子的变化特征［J］．现代医院，2015，15(3):58－59．

［5］ LUOL，LIANG H Y，HU Y S，LIU W J，et al．Epidemiological，virological，and entomological characteristics of dengue from1978 to 2009 in Guangzhou，China［J］．J Vector Ecol，2012(37):230－240．

［6］ JING Q L，YANG Z C，LUO L，et al．Emergence of dengue virus 4 genotype II in Guangzhou，China，2010:survey and molecular epidemiology of one community outbreak［J］．BMC Infect Dis，2012(12):87．

［7］ HUANG M，ZHANG Y J，LIN M Q，et al．Sequence analysis of envelope genes in dengue viruses from Fujian province，2004－2010［J］，Chinese Journal zoonoses，2012，28(10):973－977．

［8］ 陈艳佳，熊建英，朱 利，等．4种血清型登革病毒NS1蛋白序列及B细胞抗原表位特异性分析［J］．现代预防医学，2013，40(1):117－123．

［9］ 邓 掌，张海林．全球登革热和登革出血热流行状况及防治研究进展［J］．中国热带医学，2009，9(12):2318－2321．

［10］JIANG T，YU X D，HONG W X，et al．Co－circulation of two genotypes of dengue virus serotype 3 in Guangzhou，China，2009 ［J］．Virol J，2012，9:125．

［11］吴 烽，钟玉清，陈胤瑜，等．登革热传入性风险评估指标体系的研究［J］．现代预防医学，2006，33(10):1964－1966．

The Molecular Characteristics of Envelope Gene of DENV－3 in Guangzhou During from 2009 to 2010

LIANG Xueying，JING Qinlong，LI Yilan，et al

Objective To explore the variation and transmission pattern of DENV－3 in order to provide scientific suggestions for control and prevention dengue fever．MethodsRT－PCR test was conducted in blood samples collected from suspected dengue fever cases during 2009 and 2010．Positive serum was arranged for viral culture on C6/36 cell．The envelope(E)genes of viruses were sequenced and compared with previously published E gene sequences of global representative DENV－3 strains available in GenBank，which also included isolates circulating in other provinces of China．ResultsA total of 13 isolates(7 from 2009 and 6 from 2010，respectively)were obtained from human serum samples．Phylogenetic analysis revealed that the isolates were grouped into three genotypes(I，III，V)and then two clades within genotype III(genotype I from Indonesia，genotype III clade A from Cote dIvoire，genotype III clade B from Tanzania and genotype V from Philippines)．In addition，there were 1．3%－9．0%and 0．5%－3．9%differences in the nucleic and deduced amino acid sequences between the 2009 and 2010 strains，respectively．ConclusionsThe DENV－3 viruses from 2009 to 2010 may not come from the continuous spread of an epidemic strain or the re－emergence of the 2009 strains in the 2－year period．The introduction of different DENV－3 genotypes following more than one geographical route may be an important contributing factor during 2009－2010 dengue epidemics in Guangzhou．

Dengue;DENV－3 serotype;Molecular Biology

R181．2+4

A

10．3969/j．issn．1671－332X．2016．09．005

广东省自然科学基金(编号:2015A030313784);传染病预防控制国家重点实验室项目(编号:2014SKLID308);广东省科技计划项目(编号:2013A020229006;2013A020229005)

梁雪莹 景钦隆 李意兰 曹 庆 魏跃红 罗 雷:广州市疾病预防控制中心 广东广州 510440

罗 雷