地肤病毒病的病原分析

弓 强，张春明，牛颜冰

（1.山西中医学院，山西晋中030619； 2.山西省兴县综合检验检测中心，山西兴县033600；

3.山西农业大学，山西太谷，030801）

地肤病毒病的病原分析

弓 强1，张春明2，牛颜冰3

（1.山西中医学院，山西晋中030619； 2.山西省兴县综合检验检测中心，山西兴县033600；

3.山西农业大学，山西太谷，030801）

目的：分析地肤病毒病的病原。方法：在生物学检测的基础上，提取病毒双链RNA（dsRNA），合成单链cDNA后经多重PCR扩增、测定序列并分析，对地肤病毒病进行了鉴定。结果：有明显花叶症状的地肤由蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）侵染所致。将地肤分离物（Isolate-DF）中部分病毒序列进行比对分析，发现其与已报道的15个不同来源BBWV2序列的同源性为79.9%～88.0%。结论：通过分子鉴定，首次证实我国药用植物地肤上发生的花叶病毒病系由BBWV2侵染所致。

地肤；生物学检测；多重PCR扩增；蚕豆萎蔫病毒2号

地肤（（Kochia scopria））别名扫帚菜、扫帚苗、绿帚，为藜科（Chenopodiaceae）地肤属一年生草本植物，原产欧洲、亚洲，我国山东、江苏、河南、河北、山西等地有人工栽培［1］。地肤是传统的中药材，全草入药，种子即是中药材中的“地肤子”，嫩茎叶可食用，又是理想的油脂原料［2］。地肤的药用价值始载于《名医别录》，其中记载“地肤苦、寒。入肝、大肠、小肠三经”［3］，主治心血管疾病、尿痛、尿急、小便不利、荨麻疹，外用治皮癣及阴囊湿疹等［4］。地肤营养价值丰富，是一种极好的野生蔬菜，含有人体所需的多种氨基酸，种子中含有三萜甙和脂肪油，碘值约140左右［2］。同时地肤中丰富的亚油酸具有降低人体内血清胆固醇和甘油三酯的功能，并可软化血管和阻止血栓形成，是心血管病患者的良好药物［3］。此外，地肤营养成分丰富，可作为牧草及加工成家禽和家畜的饲料［5］。

笔者在对山西省晋中地区进行中药病害调查时，发现地肤表现出严重的花叶病毒病症状，严重影响该植物的质量和产量。为了确定该病害的病原，本研究利用生物学接种、病毒dsRNA提取、单链cDNA的合成、多重PCR扩增等手段对表现花叶病的地肤样品进行了病毒病原的分离检测与鉴定，确定其为BBWV2侵染所致，并对Isolate-DF分离物中部分病毒核酸序列进行了比对分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

病样采自山西省晋中地区，植株叶片表现出典型花叶症状的地肤病株叶片。

主要试剂：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）、RNasin核酸酶抑制剂等，购自Promega公司；克隆载体pMD 18-T购自TaKaRa公司、Taq plusDNA polymerase、Taq DNA polymerase、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等，购自生工生物（上海）公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生物学接种试验 将呈现花叶、皱缩现象的疑似染病地肤的叶片磨碎，汁液接种于盆栽培育的番茄幼苗上，并以接种健康植株汁液的番茄幼苗为对照，定时观察症状并记录。

1.2.2 植物病原双链RNA（dsRNA）的提取 参考牛颜冰等［6］和Tzanetakis I E等［7］的方法提取植物病原双链RNA（dsRNA）。

1.2.3 单链cDNA的合成 以提取的病样dsRNA为模板，OligodT为引物进行反转录扩增，并以健康地肤作阴性对照。所使用OligodT引物为：5′-TATGACACGCGTCGACTAGC（T）16-3′。

20 μL反应体系为：dsRNA模板3 μL、Primer OligodT 1 μL、dNTP Mixtures（10 mM）6 μL、ddH2O 4.7 μL，90℃水浴5 min，迅速冰上冷却3 min；再加入5×RT Buffer 4 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 0.8 μL；反应程序为：42℃1 h，70℃15 min，反应结束后保存于-20℃。

1.2.4 多重PCR扩增 以上面合成的单链cDNA为模板、以CMV-CP-F/R、BBWV2-F/R、PVX-CPF/R为特异引物进行多重PCR扩增，以健康地肤作为阴性对照。

50 μL反应体系为：ddH2O 38 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixtures（10 mM）1 μL、Primer F/R（CMV-CP、PVX-CP、BBWV2）0.5 μL/0.5 μL、Taq plus DNA polymerase 0.5 μL、cDNA 2.5 μL。反应程序为：94℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，36个循环；72℃10 min，4℃保存。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 PCR产物克隆及序列分析 将所得的PCR产物经电泳割胶回收纯化后，与载体PMD18-T连接，并转化大肠杆菌DH5α，经克隆、筛选及菌液PCR鉴定后，将带有重组质粒的菌株，以菌液形式进行测序经形式直接送至生工生物（上海）生物工程有限公司测序。

测序结果经Blast比对进行同源性分析和分子进化分析；序列分析由DNAMAN、Clustal X、DNASTAR等软件完成，系统进化树用MEGA 4.0软件构建。

2 结果与分析

图1 染病地肤汁液接种番茄幼苗后的症状

2.1 生物学检测结果

经摩擦接种实验，将其上携带的病毒接种到番茄幼苗上。接种后番茄苗上表现与地肤上类似的症状，即典型的花叶、卷曲、皱缩等症状（图1）。

2.2 病毒双链RNA（dsRNA）的提取

成功从表现典型花叶、卷曲、皱缩等症状的地肤植株中提取dsRNA，以健康地肤植株作为对照。dsRNA用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，在琼脂糖凝胶中分离得到大小3 000～7 000 bp的明亮条带（图2）。依据其基因组大小推测该病毒可能为马铃薯X病毒属（PVX）、黄瓜花叶病毒属（CMV）和蚕豆萎蔫病毒属（BBWV）等成员之一，或多种病毒的复合物。

图2 病毒dsRNA琼脂糖凝胶电泳

2.3 多重PCR扩增

以健康地肤作阴性对照。经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物大小为1 183 bp，与BBWV2-F/R引物设计预期扩增片段相符（图3）。

图3 多重PCR检测结果

2.4 序列分析

样品由生工生物（上海）生物工程有限公司进行测序，其所插入片段大小均为1 183 bp，将该分离物命名为Isolate-DF。并对该分离物与GenBank收录的15个不同来源的BBWV-2进行同源性比较分析（表1、图4）。结果发现，Isolate-DF与中国福建分离物BC（FJ485685）同源性最高，达到88.0%；而与日本分离物L（AB018700）同源性最低，仅为79.9%。

表1 Isolate-DF与15个BBWV-2分离物的同源性比较

3 结论与讨论

1979年Morris& Dodds首次对dsRNA技术报道至今，其已在植物病毒研究中大量应用［8］。因为大多数植物病毒是RNA病毒，其在复制时会在植物细胞内产生较大分子量的dsRNA［9-11］，并且易从大多数植物材料中分离出来，其包含着病毒基因组的所有信息，并且可有效地解决因病毒含量低、植物抑制物和病毒颗粒不稳定等所带来的种种问题［7］，是用于病毒基因组克隆和测序研究的最佳选择。此外，dsRNA的提取会因植物的不同而提取条件有所不同。本试验采用的dsRNA提取方法是将牛颜冰等［6］和Tzanetakis等［7］的方法稍作修改，地肤上分离得到一个BBWV分离物，并将其命名为Isolate-DF，采用多重PCR技术获得该分离物RNA2上的部分核苷酸序列，全长为1183bp。将该分离物与已报道的15个不同来源的BBWV-2分离物进行同源性和系统进化分析，结果表明：在核酸水平上，Isolate-DF与其它分离物的同源性为79.9%～88.0%，与中国福建分离物BC同源性最高，达到88.0%；与日本分离物L同源性最低，仅为79.9%；与另外13个分离物的同源性均低于85.0%；表明该分离物为蚕豆萎蔫病毒属成员。通过分子鉴定，首次发现BBWV-2在我国药用植物地肤上发生，该结果将为预防和控制地肤病毒病提供一定的参考依据。

图4 基于Isolate-DF和已报道的15个BBWV-2分离物构建的同源树

由于Isolate-DF与已报道的BBWV-2的同源性最高仅为88.0%，在系统关系树中只形成一个独立的分支，以及其能独特地侵染并在地肤上进行繁殖，而且造成严重的病害，因此我们推测其可能为蚕豆萎蔫病毒属中的一个突变种或者为该属的一个新株系。

［1］徐公芳.地肤的特征、特性与利用价值［J］.草业科学，2006，23（10）：106-106

［2］路洪顺，王曼.地肤的利用价值和栽培技术［J］.中国林副特产，2001（4）：39-39.

［3］林紫玉，张健伟，盖无双，等.地肤的利用价值及开发前景［J］.山东林业科技，2007，1（1）：97-98.

［4］谢宗万.全国中草药汇编［M］.北京：人民卫生出版社，1975.

［5］郑艺梅，卿中全，刘汉珍，等.地肤营养成分研究［J］.饲料研究，1999，1（9）：20-21.

［6］牛颜冰，姚敏，王德富，等.臭椿病毒病病原鉴定［J］.植物病理学报，2011，41（4）：437-440.

［7］Tzanetakis I E，Martin R R.A new method for extraction of double-stranded RNA from plants［J］.Virol Methods，2008，149（1）：167-170.

［8］Koga R，Horiuchi H，Fukuhara T.Double-stranded RNA replicons associated with chloroplasts of a green alga，Bryopsis cinicola［J］.Plant Molecular Biology，2003，51（6）：991-999.

［9］Krajacic M，Ivancic-Jelecki J，Forcic D，et al.Purification of plant viral and satellite double-stranded RNAs on DEAE monoliths［J］.J Chromatogr A，2007，1144（1）：111-119.

［10］Tzanetakis I E，Keller K E，Martin RR.The use of reverse transcriptase for efficient first-and second-strand cDNA synthesis from single-and double-stranded RNA templates［J］.Virol Methods，2005，124（1-2）：73-77.

［11］Balijja A，Kvarnheden A，Turchetti T.A non-phenol-chloroform extraction of double-stranded RNA from plant and fungal tissues［J］.Virol Methods，2008，152（1-2）：32-37.

（编辑：张世霞）

Pathogenic analysis of kochia scoparia virus disease

Gong Qiang1，Zhang Chunming2，Niu Yanbing3
（1.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan Shanxi 030024；2.Xingxian Comprehensive Testing Center of Shanxi Province，Xingxian Shanxi 033600；3.Shanxi Agricultural University，Taigu Shanxi 030801）

Objective：Analyze the pathogeny on the Kochia scoparia virus disease.Method：The Kochia scoparia virus was identified，the virus double-stranded RNA（dsRNA）was extracted，and the single cDNA was synthesized using the multiplex PCR amplification method，and the target sequence was analyzed.Result：The Mosaic symptoms of K.scoparia were caused by the infection of Broad bean wilt virus 2（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）.Sequence homology analysis revealed that the partial virus sequence from Isolate-DF of K.scopria showed 79.9%～88.0%homology with other 15 reported BBWV sequences.Conclusion：The results of nucleotides homology analyzing firstly confirmed that the Mosaic virus disease of medicinal plant K.scopria was caused by BBWV2 in china.

Kochia scopria；Biological detection；the multiplex PCR amplification；Broad bean wilt virus 2

R285

A

1671-0258（2016）04-0025-03

弓强，硕士，助教，E-mail：gongqiang012@163.com

牛颜冰，教授，博士，E-mail：niuyanbingbest@163.com