高效液相色谱法测定油脂类保健食品中的维生素E

□ 王皛蕾 宁夏大学 刘敦华 宁夏食品检测中心

高效液相色谱法测定油脂类保健食品中的维生素E

□ 王皛蕾 宁夏大学 刘敦华 宁夏食品检测中心

维生素E为脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是体内有效的抗氧化剂，其中以α-生育酚的生物效应最高，具有促进生育、抗衰老的作用，参与细胞DNA合成的调节，可提高免疫力和对抵抗力。维生素E缺乏可引起生殖障碍，肌肉、肝脏、骨髓和脑功能异常，红细胞溶血和胚胎发生缺陷等。但维生素E在人体内不能合成，需由食物摄人。

近年来，随着生活水平的提高，人们保健意识不断加强，目前已有8种具有维生素E活性的化合物从生物资源中分离出来，分别为D-α-、D-β-、D-γ-及δ-生育酚和D-α-、D-β-、D-γ-及δ-生育三烯酚。食品添加剂天然维生素E的α-生育酚在食品工业中可用作营养强化剂、抗氧化剂；混合生育酚用作抗氧化剂，因此，在油类保健食品中一般添加混合生育酚作抗氧化剂。反相高效液相色谱法，综合精密度、回收率、分析时间和实验安全性等方面考虑，本实验优化国家标准的前处理方法，建立了反相高效液相色谱法检测油类保健食品中的D-α-生育酚，为该类保健食品制定质量标准提供参考依据。

材料与方法

仪器与试剂

实验仪器：安捷伦高效液相色谱仪配DAD，分析天平。

材料：枸杞油胶丸，试剂与对照品，无水乙醇色谱纯，抗坏血酸分析纯，氢氧化钾分析纯，石油醚分析纯，纯化水，D-α-生育酚（纯度99%）。

仪器条件

色谱柱：XDB C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；流速：1.7 mL/min；柱温：20 ℃；进样量：20 μL；波长：300 nm；流动相：A为甲醇，B为水；等度洗脱比例为（98+2）。

标准溶液的制备过程

1 标准储备液的配制

精确称取D-α-生育酚标准品0.05 g置于50.0 mL棕色容量瓶，用无水乙醇定容，浓度1.0 mg/mL，储备液于-20℃中储存备用。

2 标准储备液浓度校正

精确移取D-α-生育酚储备液150 μL注入3.0 mL无水乙醇的比色皿中，以无水乙醇为空白，入射波长为294 nm 测定其吸光度。校正公式：C0=A/E×100×3/V×10-3，其中，C0是维生素浓度，单位为 g/ mL；A是维生素的平均紫外吸光度；E是某维生素1%的比吸光系数；V是加入标液的量，单位为 μL。

本实验中，D-α-生育酚比吸光系数为71，经分光光度计校正D-α-生育酚储备液浓度为987.7 μg/mL。

3 标准工作溶液配制

分别取D-α-生育酚标准储备溶液0.5、0.75、1.0、1.5 mL和2.0 mL于10.0 mL容量瓶（A级），加无水乙醇定容到刻度，分别配制成49.39、74.08、98.77、148.16 μg/mL和197.54μg/mL的标准液。

样品前处理

称取约1.0 g样品于250 mL三角瓶中，称取0.5 g抗坏血酸于50 mL棕色容量瓶中，依次加入5 mL水，30 mL无水乙醇使其完全溶解，将溶解后的抗坏血酸全部加入试样中混匀，再加入10 mL氢氧化钾溶液混匀，充入氮气排除空气，盖上胶塞。放在恒温磁力搅拌器上，水温控制在（53±2）℃，皂化45 min后，取出冷却至室温。将皂化液全部转入500 mL分液漏斗中，加入100 mL分析纯石油醚，来回振摇，排气，室温下均匀震荡10 min后静置分层，将水相转移另一分液漏斗中按上述方法进行重复提取。合并有机相，用清水洗至中性。有机相通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液于旋转蒸发器上在40 ℃的充氮条件下蒸发近干（不能完全蒸干），在40 ℃下氮吹仪上吹干。用50 mL无水乙醇溶解定容，过有机膜0.45 μm，上机测定。

结果与讨论

样品前处理方法的优化

国家标准方法采用苯并[e]芘为内标，氢氧化钾溶液皂化，乙醚提取，无水乙醇为溶剂，测定样品的维生素E。但苯并[e]芘接触毒性极大，强致癌物，因此为了实验人员的身体健康将乙醚试剂换为石油醚，内标法定量换为外标法定量，以国家标准方法为准并进行了优化改进，适用于保健食品中维生素E的分析。

色谱条件的选择

1 色谱柱的选择

本实验选择了250 mm的C18柱分离D-α-生育酚，实验表明300 mm的长柱有良好的分离效果，能很好地分离D-α-生育酚和杂质峰。

2 流动相

本方法采用甲醇、水等度洗脱，让目标物得到有效地分离。

方法的线性范围确认

在实验条件下，对标准工作溶液进行测定，结果表明，D-α-生育酚在49.39～197.54 μg/mL内有良好的线性关系，r＞0.999 7。

方法的回收率

称取10 份样品,分别添加3.00 mL浓度为987.7 μg/mL标准储备液进行加标回收实验。本方法回收率95.8%～101.1%，RSD为2.53%，说明该方法准确度和精密度可满足D-α-生育酚的检测要求。

方法检出限

以标准溶液的色谱响应值计算，检出限为91.8 ng，色谱峰的信噪比为SN=5.1＞3，能满足样品的测定需求。

不确定度评定

用液相色谱法测定保健食品中D-α-生育酚的含量，测定两份样品取其平均值报告结果，其结果和扩展不确定度为（270.86±7.58）mg/100g，包含因子k=2，相对扩展不确定度为2.8%。

结论

国家标准采用苯并[e]芘为内标，但苯并[e]芘毒性大，强致癌物，对实验人员健康造成很大的危害，且内标含量极大，毒性强。本文方法操作简捷，结果准确可靠，安全环保，适用于含有油类的保健食品检测混合生育酚。