三倍体葡萄胚挽救育种研究现状与展望

路凤珍，张娜，田淑芬*，温晓敏，陈三春（. 天津市农业科学院葡萄研究中心/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 30092；2. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

三倍体葡萄胚挽救育种研究现状与展望

路凤珍1，2，张娜1，田淑芬1*，温晓敏1，2，陈三春1，2
（1. 天津市农业科学院葡萄研究中心/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192；2. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

综合分析国内外相关文献，阐述了三倍体葡萄胚挽救技术的研究进展，探讨了影响三倍体葡萄胚挽救育种成功的主要因素：亲本选择、接种时期、培养基种类等，概述了三倍体葡萄鉴定方法，驯化移栽过程中的影响因素，包括基质类型、生根粉浓度等，并对胚挽救技术在三倍体葡萄育种上的发展进行展望。

三倍体葡萄；胚挽救技术；育种；研究进展

多倍体育种是培育果树新品种重要途径之一，三倍体葡萄因具有无核或少核、果粒大、产量高、植株生长旺盛等优良特性，使其成为葡萄育种的目标之一，目前二倍体与四倍体进行有性杂交是获得三倍体葡萄的有效途径，其次还可以通过二倍体品种间杂交、自然选育、三倍体芽变、核融合、胚乳培养和花药培养等途径获得三倍体葡萄品种。但在常规条件下，采用以上技术进行品种间杂交存在较严重的杂交障碍，往往出现坐果率低、杂种胚早期败育、亲和力差、胚乳解体或获得三倍体杂交种子生活力较低等问题，获得杂交后代比较困难［1-3］，使用胚挽救技术可提高其杂种后代的成活率［4］。

自1982年Ramming等［5］首次报道了利用胚挽救技术培养无核葡萄胚珠并获得2株实生苗以来，无核葡萄胚挽救开始引起世界各国葡萄育种者的关注［6-18］。Yamashita等［4，19-20］首先利用有核四倍体葡萄和二倍体葡萄杂交，经胚珠培养，最高成苗率达42.4%，并成功获得了三倍体植株。徐海英等［21］通过胚挽救获得部分杂种苗，其中约23%为三倍体单株。潘春云等［22］利用胚挽救技术获得三倍体植株，成苗率为0～5.3%。郭印山等［23］以葡萄二倍体与四倍体进行胚挽救得到三倍体植株（27.59%）。此外，李世诚等、赵艳华等、石艳等、程琳琳等［24-27］也都通过胚挽救培育出了三倍体葡萄。

在多倍体葡萄育种方面，日本已培育成功的三倍体无核葡萄品种有：尾玲（Yileyi）、戴拉王（King Dela）、蜜无核（Honey Seedless）、甲斐美领（Kai Mirei）、夏黑（Summer Black），我国选育成功的三倍体无核品种—无核早红（Earlyred Seedless）［28］。但是，由于现在对无核性状的遗传规律认识还不够深入，三倍体葡萄胚挽救育种技术尚不成熟，其胚挽救中胚的发育率、萌发率和成苗率较低仍是困扰三倍体胚挽救育种的一个难题。作者通过查阅了相关的资料，对三倍体葡萄胚挽救技术研究的进展进行总结，系统研究杂交组合的亲本选择、接种时期、培养基种类及驯化移栽方式对胚培养效果的影响等，以达到提高三倍体葡萄杂交胚萌发率和成苗率的目的。

1　三倍体葡萄胚挽救育种

1.1三倍体葡萄胚挽救育种影响因素

1.1.1亲本选择

胚挽救技术可大大缩短育种周期［4］，提高后代中无核杂种的比率［5］，可以阻止三倍体杂交幼胚的早期败育，形成三倍体植株。而杂交组合的基因型不同，其胚挽救的成功率也将不同。

（1）母本的选择——以二倍体葡萄为母本。在无核葡萄胚挽救过程中，选择适宜的母本是杂交组合的关键。不宜采用可挽救性差的品种，如喜乐［24］、玫瑰露［1］、爱莫无核［27］等成苗率低于6%，不宜做母本。赵艳华等［29］以玫瑰香×巨峰的杂交胚珠为试材进行胚挽救研究，成苗率最高为36%。而闫爱玲等［30］以玫瑰香×京优杂交，成苗率为24.57%、秋红×峰后杂交成苗率为35.32%。Flame Seedless［31］、Sweet Scarlet［31］、无核白［31］、无核红宝石［23］等也是成苗率较高的品种，适宜用作母本。

（2）父本的选择——以二倍体葡萄为父本。在无核葡萄胚挽救育种中，父本基因型对杂种成苗也有一定影响［32-33］，基因型差异导致亲本亲和力的不同［34］。山下裕之等［4］利用四倍体葡萄和二倍体有核葡萄杂交，经过胚珠培养最高成苗率可达42.4%。而且，四倍体葡萄为母本比二倍体为母本获得的后代三倍体的比例高，但是二倍体为母本要比四倍体为母本的胚发育率明显提高［19］。郭印山等［35］研究了有核葡萄二倍体与四倍体正交、反交的亲和力大小，结果显示正交的亲和力大于反交的，但是杂交后代三倍体的比例却低于反交的。杨德龙等［36］通过研究也得到同样的结果。

1.1.2接种时期

最佳接种时期的确定是胚挽救成功的关键因素［37-42］之一。最佳接种时期是胚发育程度最高而尚未达到败育的时期，在此时进行胚培养可以获得最多数量的萌发苗［43］。张利等［16］研究证明了无核葡萄胚珠发育过程中存在一个急剧败育期的推测，以及最适胚挽救时期与浆果开始软化期作为接种最佳时期的研究基本一致［44］。

但目前，还没有一个确定最佳接种时期的适用方法，大多数学者采用开花后天数作为接种时期的指标，间接地反映胚珠内胚的发育程度。不同品种间幼胚发育的进程存在差异，因此胚挽救的最佳接种时期不同。以四倍体玫瑰香为母本的胚珠萌发率分别在花后65 d和70 d最高［35］。无核白为母本的杂交胚珠在授粉后35 d接种发育率最高；巨峰为母本的杂交胚珠在授粉后55 d发育率最大［45］，过早或过晚取样均导致成苗率降低。取样时期的确定与母本的成熟期有很大关系，母本相同的杂交组合最佳取样时期相差不大。徐海英等［21］研究发现，早熟品种为授粉后6～9周，中熟品种为授粉后7～10周，晚熟品种为授粉后9～12周。但在实际应用中，要考虑具体的环境条件、地理位置及气候条件，同一品种在不同年份的最佳取样时期也不尽相同。

1.1.3培养基

筛选适宜的培养基是获得无核葡萄胚挽救成功的关键因素［32］。胚挽救过程可分为3个阶段：胚珠内胚发育阶段，使胚珠充分发育成萌发力较强的胚；胚萌发阶段，促使幼胚萌发；成苗阶段，使已萌发的胚发育成正常植株。不同阶段所选用的基本培养基类型和所需营养物质不同。

（1）基本培养基。采用的基本培养基种类主要有Nitsch［54］、White、ER［27，35，38，46，47，52，54-57］、B5［48］、1/2MS、MS［24，49］、MM4［50］、NN［7，32］等。自Emershed和Ramming利用ER培养基用于胚珠发育并取得良好效果以来，Nitsch或ER作为无核葡萄胚珠发育基本培养基获得了良好效果，而胚萌发和成苗培养基选用1/2MS或1/2B5较好［24，51］。郭印山等［53］认为二倍体与四倍体杂交胚在无机盐浓度较低的White培养基上更有利于其发育。在试验过程中，对于不同杂交组合，应进行多次重复试验，以找出适合的相应培养基类型，提高胚挽救成功率。

（2）添加物。多数研究者认为，在培养基中添加适宜的外源激素对胚的发育及萌发有促进作用［6，57-59］。如在Nitsch培养基中添加IAA和GA3，对提高无核葡萄胚珠发育率起到关键作用［60］；IBA能促进幼胚萌发［56，61］；在MM1培养基基础上添加甘氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸和脯氨酸有利于胚的发育和成苗［62］等。刘佳等［63］在胚珠发育阶段，使用ER+1.5 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3培养基最适宜离体幼胚的发育；在胚萌发阶段，使用WPM+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA +0.5 mg/L GA3培养基萌发率最高。激素的添加对胚发育率及成苗率也有一定的促进作用［64］。但是在唐冬梅等［54］的研究中，在ER培养基中添加IAA和GA3将抑制胚珠发育。在基本培养基中适当加入活性炭可防止浆果类胚珠培养出现褐化现象，使用浓度通常在0.1%～0.3%之间。

1.1.4培养条件

（1）光照。在三倍体葡萄胚挽救过程，多数学者在培养阶段会提供适宜的光照，光质对根芽分化、叶绿体形成等都有影响。自1955年Capite最早将光因子应用于植物组织培养调控以来，有关光质在植物离体培养中的作用研究也越来越多［66］。一般光周期为12～16 h，光照强度2000 lux。苏小玲［66］研究了不同光质对葡萄试管苗生长的影响，结合光质对幼胚和试管苗生长的影响，考虑不同光质对无核葡萄胚挽救成苗率的影响，开展相关的研究。而唐冬梅等［67］研究发现黑暗条件下有利于胚珠的发育，可能因为暗培养刺激了内源激素的分泌［68］。

（2）温度。在胚挽救过程中，温度可以决定呼吸速度和控制植物组织代谢过程。最适温度范围为23～28 ℃之间。大多数研究者在胚挽救过程采用的是恒温培养，温度一般控制在（25±2） ℃，也有人认为在低温条件在对胚发育和萌发有着促进作用，Gray等［7］、Spiegle等［60］认为胚萌发需要低温的状态。蒋爱丽等［69］认为，大小不同的胚珠在胚珠培养阶段，幼胚对低温的反应不同，在培养“大败育型”胚珠时，因为胚已经进入休眠，低温处理同时附加BA，胚的萌发率最高。低温处理一般针对的是成熟种子的萌发，低温可打破种子休眠，促进种子萌发。而对于从正生长发育的果实中获得的胚珠来说，是否需要经低温处理打破休眠目前值得探讨和研究［70-71］。

（3）湿度。培养过程中适宜湿度对胚挽救成功与否也很重要，在无核葡萄胚挽救培养的三个阶段中，胚珠生长对湿度的要求有所不同，王跃进等［72］创建的无核葡萄胚挽救技术体系中建议胚珠接种在固液双相培养基中，先把离体胚珠接种在固体培养基中，然后再倒入一定量的液体培养基，用量以盖住整个胚珠为宜，这对于保持离体胚珠生长的湿度环境有很大作用，胚珠内胚的发育率较高。此外，培养基的pH值对胚的生长有明显影响，不同品种所需pH值不同。

1.2三倍体葡萄的鉴定

1.2.1体细胞染色体计数

关于二倍体与四倍体葡萄杂交幼苗染色体倍性鉴定方法的研究，染色体计数法是最直接、最传统、最准确的方法。现有研究表明，可以利用染色体计数法对通过胚挽救技术获得的部分杂种苗进行鉴定［21，23，30］。

1.2.2流式细胞仪鉴定

由于葡萄染色体数目较多（2n=38），对染色体计数操作复杂且费时费力，目前快速有效地鉴别果树染色体倍性的方法是利用流式细胞仪进行鉴定［65］，它可以直接测定细胞内的DNA含量［73-74］，从而鉴别植株的染色体倍性水平，而且利用此方法的取材部位不受限制［25］。利用流式细胞仪对试管苗的细胞内DNA的相对含量进行测定，结果表明，随着植株倍性水平的增加，DNA的相对含量也随之成倍增加［25，31，75］。采用流式细胞仪快速全面地进行半定量分析后，初步筛选出三倍体单株，再进一步通过染色体计数法加以直观验证，可较为系统地对获得的杂种后代进行倍性的早期鉴定。

1.2.3形态学鉴定

多倍体一般表现叶片肥厚、果粒较大、叶色浓绿、气孔保卫细胞变大、枝干较粗、花较大。如三倍体葡萄一般生长旺盛，年生长量大，果实无核和少核［76-78］。有的花而不稔［24］。从组织发生学的角度看，气孔大小、保卫细胞大小和其内叶绿体数由分生组织的LI层衍生而来［79-81］，与倍性呈正相关关系，而气孔密度与倍性呈负相关。花粉粒是由LII层衍生胞原组织形成［79-81］，花粉粒大小与染色体的数目呈正相关，四倍体花粉粒覆盖层粗糙、穴状雕纹的深度与二倍体亲本有明显的不同［82］。利用形态学鉴定法可获得可靠的结果，但须进行重复试验，并且对果实种子是否无核的鉴定要等到开花结果才可以进行，鉴定周期长，工作量大，并且极易受自然环境的影响［83］。

1.2.4分子辅助标记鉴定

利用分子标记辅助选择，可以直接在DNA水平上进行分析［84］，从而提高葡萄遗传育种效率，并可用于杂种后代早期鉴定。利用RAPD标记F1代的性状进行早期鉴定，淘汰有核杂种［85，90］，也可以进行抗病性辅助选择［39］和鉴定葡萄的无核性状［89］与果实重量［88］。AFLP技术也可对突变体进行早期鉴定［86］。王跃进等［87］利用葡萄无核基因DNA探针对无核葡萄品种进行检测，并初步应用于辅助育种。与形态学鉴定法相比，分子辅助标记法不仅可以提高选择的准确率，而且不必等到植株开花结果，在幼苗时期就可以进行［91］，但需要分子引物，试验过程比流式细胞仪复杂。

1.3影响驯化移栽的因素

较多报道只是涉及实验室试管育苗的结果，而关于试管苗的驯化移栽的研究较少。葡萄胚挽救苗驯化移栽的过程是一个由半异养到自养、高湿到低湿、恒温到变温、无菌到有菌的过程［92-94］，试管苗的生理特性和组织结构与大气环境中生长的植株有较大差别，如叶表面角质层较薄，气孔开度大且无开闭功能，栅栏组织发育不完善，细胞间隙较大等，因此，炼苗移栽时易过度失水萎蔫，移栽成活率普遍较低，甚至不能成活［95-96］。若要获得较高的移栽成活率，需要驯化移栽过程中的各环节达到最佳搭配。

1.3.1基质类型

合理配制移栽基质是影响试管苗驯化移栽成活的关键因素，任杰等［97］试验表明，采用基质分层技术（即上层选用孔隙度大、透气好的蛭石或珍珠岩，下层选用保墒性能好的田间土）进行移栽，胚挽救苗的成活率显著高于使用单种特定基质。李玉玲等［98］以椰糠作为移栽基质的组成部分，其可改善透气性，促进根系毛根的生长，能显著提高葡萄胚挽救苗的成活率。纪薇等［99］认为珍珠岩∶草炭∶园土=4∶1∶1作为基质的移栽效果较好。

1.3.2生根粉浓度

蘸取一定浓度的生根粉溶液可以提高驯化移栽的成活率。王刚等［84］认为1.0 mg/L生根粉溶液浸泡根系3 min，植株各项生理指标较好且成活率最高。纪薇等［100］研究结果表明，蘸取浓度为200 mg/kg的生根粉（ABT10）30 s+培养室炼苗15 d+温室炼苗15 d的移栽方式较好。

2　展望

培育大粒、无核、优良抗性的三倍体葡萄是葡萄育种的主要目标之一，利用胚挽救技术将葡萄二倍体与四倍体的杂交胚进行离体培养，大大缩短育种年限且极大地提高了三倍体葡萄的育种效率。随着现代生物技术的不断发展和研究的不断深入，胚挽救技术结合分子生物学技术将会大大提高葡萄品种的选育效率。天津市农科院葡萄研究中心利用分子生物技术和田间选种结合的方法从天津汉沽种植的茶淀玫瑰香葡萄中鉴别筛选出的玫瑰香优系葡萄，较普通葡萄香气浓郁，以此为亲本，利用胚挽救可选育优质的三倍体葡萄，该项技术也会日趋成熟和完善。

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10.13414/j.cnki.zwpp.2016.05.038

2016-07-21

天津市农业科学院院长基金（15010）。

路凤珍（1990-），女，在读研究生，研究方向葡萄遗传育种。

田淑芬（1966-），女，博士，研究员，主要从事葡萄栽培与选育种方面的研究。E-mail： tianshufen@263.net