猪瘟病毒功能基因的研究进展

宋淑英　张泽辉　王庄

摘要：猪瘟病毒为猪瘟的病原，该病流行范围广、致死率高且难以清除，给生猪养殖业造成巨大威胁。因此对病毒的基因结构、致病机理以及疫苗防控等方面的研究一直都是热点。对猪瘟病毒功能基因的研究进展进行了介绍。对其整体基因结构进行了概述，对其功能区域，特别是对病毒RNA 3UTR与5UTR区域的结构，及各区域在病毒复制、表达过程中的功能进行了详细介绍。同时对病毒RNA ORF所含基因，以及其表达产物在病毒致病性中的作用进行了简要说明。为进一步探明病毒的致病机理，以及防控疫苗的研制提供理论帮助。

关键词：猪瘟病毒；功能基因；非翻译区；病毒复制

中图分类号：S852.65+1 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2016）01-0010-03

猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种接触性、热性、急性且致死率较高的传染性疾病[1]。病猪通常因全身血管壁变性，造成广泛出血、脏器坏死、梗塞而导致死亡[2]。隐性感染和慢性感染的猪会长期排毒，成为潜在感染源，对猪群健康造成严重危害。据统计，我国每年因猪瘟造成的经济损失已超过100亿元[3]。猪瘟严重阻碍养殖业的健康发展，并对食品安全造成威胁。因此，对该病进行全面、综合防控，具有必要的现实意义。本文对CSFV及功能相关基因、蛋白的研究进展进行介绍，为全面了解CSFV、全方位防控猪瘟提供理论支持。

1 CSFV

CSFV属黄病毒科，瘟病毒属，病毒粒子为二十面体、对称、圆形结构。为正链、单股RNA病毒[3]。粒子直径约为40 nm～50 nm，核衣壳直径约29 nm，衣壳内部包裹基因组RNA，长度约12.3 kb[4]，病毒囊膜表面被6 nm～8 nm的糖蛋白纤维穗样突起所包裹[5]。

20世纪90年代，根据遗传进化分析，CSFV被分为2个基因群，包含5个基因亚群，分别为subgroup1.1、1.2、2.1、2.2及2.3。当时影响我国的主要为基因1群，该群主要包括亚洲、南美洲分离株，及部分古典欧洲、美洲分离株和日本分离株。在九十年代末，学术界多根据CSFV的E2基因、NS5B基因以及5′-UTR对病毒进行分类[6]。目前已将CSFV分为3个基因群，共10个基因亚群，其中基因2群毒株在世界范围内广泛流行。在我国，CSFV主要由基因2群及1群，共4个基因亚群组成，分别为2.1、2.2、2.3及1.1亚群。主导毒株已由基因1群变为基因2群[7]，说明我国CSFV的传播途径更为复杂。

2 CSFV基因

CSFV基因由3′-端非翻译区（3′-untranslated region， 3′UTR）、5′-端非翻译区（5′-untranslated region， 5′-UTR）和一个较大的开放阅读框（ORF）三部分构成。在病毒RNA的3′-端缺少多聚腺苷酸结构（polyA），5′-端缺少甲基化的“帽子”结构[8]。

2.1 5′-UTR

CSFV 5′-UTR长约370 nt，不同基因群长度各异，但同群内高度保守。在5′-UTR中存在核糖体结合位点，该位点能够与核糖体18S rRNA的3′-端保守序列结合，从而起始病毒翻译过程[4]。核糖体结合位点结构的完整性对CSFV复制起决定性作用。5′-UTR中的茎-环序列能够形成稳定的发夹结构，该结构是构成核糖体结合位点的重要组成部分。最近研究表明，在5′-UTR中存在连续的21 nt序列或GTATACGAG序列，该序列的突变或缺失，能够导致病毒复制效率的显著降低甚至完全无法起始复制过程[9]。在CSFV不同基因群的5′-UTR起始密码子上游，存在一段长度为27 nt的高度保守序列，该序列可以与核糖体结合并在无“帽子”结构的情况下起始病毒的翻译过程。研究同时发现，该序列与Met tRNA与起始密码子定位过程有关。由于5′-UTR区域的高度保守性，因此常被用于CSFV分型[3]。

5′-UTR的二级结构可分为四个功能区，A、B、C和D区。其中B区为可变区，保守性最低；C区为保守区，与茎-环结构、发夹结构有关；D区的一级结构为可变区，但二级结构相对保守[10]。当5′-UTR核糖体结合位点与核糖体40S亚基形成稳定二元复合物后，起始密码子才能够准确定位核糖体P位点，CSFV翻译才能够正常进行。在此过程中，核糖体结合位点的结构与功能至关重要。分析发现，核糖体结合区域位于起始密码子的两侧363 nt～391 nt之间，结合位点的5′-边界临近病毒基因组第65位碱基[11]。核糖体结合位点可分为3个区域，其中II区及其下游区域与结合功能密切相关。当缺失部分II区及其上游序列时，结合位点仍有活性，但活性降低20%左右；当缺失部分II区及全部下游序列时，结合位点则完全丧失结合活性。进一步研究发现，核糖体结合位点的II区主要与病毒的复制能力有关，对翻译过程影响不大；而III区则主要与病毒的翻译过程有关，对病毒的复制能力几乎没有影响[12]。

除结合位点自身结构外，结合位点下游序列的结构对翻译起始及翻译效率也有很大影响。研究发现，当结合位点下游起始密码子AUG后紧接17或更多病毒自身密码子时，结合位点的翻译起始能力最强；当病毒自身密码子减少至12个时，位点起始能力降低至66%；当仅保留3个自身密码子时，位点起始能力则仅有15%。同时RNA结构分析表明，起始密码子后的序列保持单链状态时，起始位点起始翻译的效率最高[12-15]。

2.2 3′-UTR

CSFV的3′-UTR位于病毒基因组较大的ORF终止密码子（UGA）之后，有223 nt～239 nt组成，无ploy（A）尾结构，但含有一段富含AT的区域。在3′-UTR中包含两个较为稳定的茎-环结构序列（stem-loop motif，SL），分别为SL I和SL II。序列分析发现，在SL I与SL II 之间存在一段长的单链间插序列（single stranded intervening sequence， SS）[16]。研究发现，SL I和SS序列在病毒RNA复制过程中发挥重要作用，当分别或同时在SL I及SS序列中发生突变或缺失时，病毒RNA的复制能力都会减弱，甚至无法进行复制[17]。已有研究表明，CSFV的3′-UTR端SL序列以顺式作用原件的形式参与RNA复制过程。同时，3′-UTR与成熟病毒粒子的包装过程有关，但具体机制尚不明确[18]。

3′-UTR的结构完整性与病毒基因组RNA合成的起始以及合成的效率有关。研究发现，在CSFV的3′-UTR中有一段21 nt的核苷酸序列是病毒复制所必须的。缺少该段序列，病毒将无法进行复制[19]。但即使3′-UTR仅含有该段序列，而其他部分全部缺失时，病毒RNA仍能起始合成，但合成效率显著降低[20]。在21 nt核苷酸序列中，位于216位的T碱基是病毒RNA起始合成的关键位点，该位点的突变将导致病毒无法起始RNA合成；219位和228位的碱基发生突变会导致起始能力显著降低；212位碱基对起始能力无明显影响，但对RNA的合成效率影响较大。研究表明，CSFV的3′-UTR与病毒的RNA复制酶结合，起始病毒基因组RNA的复制过程。在其3′-末端存在CCCGG序列与复制酶结合有关，该序列的缺失或突变，会导致结合能力大幅降低[21-23]。

2.3 ORF

CSFV的ORF首先翻译出一个多聚蛋白（polyprotein，PPro）。PPro由3 898个氨基酸构成，并在病毒自身合成的蛋白酶及宿主细胞的信号肽酶作用下，被分解、加工为12种蛋白质。依据其编码基因的顺序，蛋白分别为Npro、C、Erns（E0）、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B。其中4种为结构蛋白，分别为C、Erns、E1及E2，其余为非结构蛋白[24]。

研究发现，在ORF中与CSFV毒力相关基因为Npro、Erns、E1及E2。CSFV强毒株基因组中任一毒力相关基因发生突变，或被弱毒株的相应基因替换后，强毒株的致病力将明显下降。Erns表达的蛋白具有淋巴细胞毒性[16]，其他3个基因表达的蛋白单独并不表现出任何毒性，推测其在维系病毒的整体致病性方面发挥作用。最近研究发现，Npro基因表达的蛋白能够与病毒基因组复制过程中形成的双链RNA中间体（dsRNA）结合，抑制其功能，并对IFN-α/β启动子具有抑制作用[25]。这种抑制作用，能够使感染细胞抵抗由dsRNA分子引起的细胞凋亡，从而导致非强毒株的持续性感染。

3 展望

CSFV给生猪养殖业带来巨大威胁，免疫接种仍是最有效的防控措施之一。目前，OIE推荐的猪瘟标记疫苗中，大部分是根据其结构蛋白E2糖蛋白而研制的。但随着对CSFV基因组研究的推进，使研发针对其他蛋白或基因的新型疫苗成为可能。如针对E2囊膜糖蛋白亚单位的标记疫苗，以及通过基因重组技术获得能够表达Npro、Erns、E1及E2蛋白的重组痘苗病毒等[23，25]，都为猪瘟的防控提供了新的思路。而随着对CSFV基因功能、作用研究的不断深入，对其致病机理也将有更加准确的阐述，也将为猪瘟的全方位防控提供帮助。

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