褪黑激素对羊生殖活动调控的研究进展

蒋维东，石长青

（新疆塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔市843300）

褪黑激素对羊生殖活动调控的研究进展

蒋维东，石长青*

（新疆塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔市843300）

随着分子生物学技术的发展，对于褪黑激素的研究日渐增多。研究发现，褪黑激素不仅是一种由松果体分泌的神经内分泌激素，而且在动物机体繁殖中的重要性也逐渐被人们认识。为了给褪黑激素的后续研究和在实践生产中的应用提供参考，本文从国内外学者对褪黑激素的合成代谢、与光照的互作关系、对羊生殖活动的影响和应用的研究以及褪黑激素受体在羊生殖活动中的作用和调控的研究进展这四个方面进行综述，说明褪黑激素及其受体在机体繁殖方面的重要性。

褪黑激素；内分泌；褪黑激素受体；生殖调控；生产应用

10.16863 /j.cnki.1003-6377.2016.05.001

褪黑激素(Melatonin,MLT)是一种带有吲哚环的神经内分泌生物活性物质，主要由松果体分泌，在视网膜、红细胞、血小板、肠嗜铬细胞、副泪腺和外周单核细胞等也可合成分泌[1]。褪黑激素可与5-HT、多肽等生物活性物质一起参与和调控机体的生长、发育、成熟和衰老等生命过程，具有十分广泛的生理作用。本文从MLT合成代谢、受体及其影响因素和MLT对羊生殖活动的影响及应用等方面，就近年来国内外的研究进展作一综述，为MLT的后续研究及在生产中的应用提供参考。

1 MLT合成与代谢特点

MLT主要由松果体合成，其过程如下[2]：首先色氨酸在色氨酸羟化酶的作用下转变成5-羟基色氨酸，然后在5-羟基色氨酸脱羧酶催化作用下生成5-羟色胺，最后在5-羟色胺-N-乙酰转移酶（NAT）和羟基吲哚氧位甲基转移酶（HIM-OT）的作用下转变成MLT。MLT合成分泌后立即释放入脑脊液、血液[3]，随体液运输到中枢神经系统与外周组织器官靶细胞膜上[4]与MLT受体相结合。

MLT的降解主要是在肝细胞中的肝微粒轻化酶作用下，生成6-羟基-N-乙酰基-5-甲氧基色胺。其中，70％～80％[5]与硫酸根结合，5％与葡萄糖醛酸结合，以硫氧化MLT的形式从尿中排出，约1％的MLT可直接从尿中排出，另外的MLT可经去甲基途径代谢[6]。

2 MLT分泌与光照的互作关系

研究发现，MLT的合成与分泌受光/暗周期信号[7]的调节：视网膜在受到光的刺激后,光信号依次传导至视交叉上核（SCN）[8]、脊髓旁核（IML）、交感神经肾上腺皮质纤维、颈上神经节（SCG）、松果体后，由松果腺将光照信息转化为内分泌信息输出。根据光照的变化，交感神经末梢传递相应的内分泌信息，使松果腺细胞释放去甲肾上腺素（NE），NE作用在松果腺细胞膜上的α和β-肾上腺素能受体，激活或者抑制NAT的活性，增加或者减少MLT含量[9]。由于受到外界光线的影响，它在松果体的合成与释放中的节律性十分明显，同时黑暗环境也会刺激松果体的分泌。光/暗周期信号的节律性变化与松果腺中酶活性节律性变化的同步化，使MLT合成与释放的节律性十分明显，具有昼夜规律性分泌的特点。但是，Vanecek（1988）研究发现，MLT的这种调节作用需要与其受体相结合后，才能发挥其生物学功能。

3 MLT受体在羊生殖活动中的作用及调控

3.1MLT受体的类型

MLT受体（MLTR）属于膜受体，是G蛋白偶联受体超家族的一员，总共包括7个跨膜段，由包含5’非翻译区到第1个细胞内环的编码区一个内含子和包含3’非翻译区及剩余的编码区的两个外显子构成（Weaver etal.1996）。哺乳动物中MLTR大多含有350个氨基酸残基（Roca et al.1996），依其分布而分为膜受体和核受体（如一些核内孤儿受体）两大类（Karasek et al.2003；Pandi-Perumal et al.2008）；根据与2-125I-MLT结合的药理和动力学特性，可将MLTR分为高亲和力的MLTR1受体和低亲和力的MLTR2（MLT3）受体；根据分子生物学方法（包括DNA和氨基酸顺序及蛋白质同源性）又将MLTR分为N端含有两个糖基化位点、高亲和力的MLTR1a型、N端仅含有一个糖基化位点的低亲和力MLTR1b型和醌还原酶家族的MLTR1c 3个亚型（Reppert等，1994；Sethi等，2008）。三种亚型的同源性在60％～80％。通常，低浓度的MLT借助MLTR1a发挥作用，高浓度的MLT借助MLTR1b发挥作用（Celiaj etal.1991）。将MLTR分为MLTR1、MLTR2、MLTR3三种亚型是在1998年的IUPHAR会议上，其中MLTR1是哺乳动物中的主要亚型。

3.2影响MLTR表达的因素

研究发现，品种、光照对MLT受体的表达都有影响。

3.2.1 品种对MLTR表达的影响

汪运舟等（2011）采用DDRT-PCR技术研究发现MLTR虽然在处于发情期的多胎的济宁青山羊与单胎的沂蒙黑山羊发情期卵巢组织中均有表达，但是前者的表达量显著低于后者（P＜0.05），说明产羔数不同的品种卵巢中MLTR表达有差异，且发情期MLTR基因在卵巢组织中的高表达是限制山羊排卵和产羔数的重要因素之一。Vanecek等（1988）认为，哺乳动物MLTR的分布比较稀疏，非哺乳动物MLTR的分布则十分广泛，而且存在种间差异。

3.2.2 光照对MLTR表达的影响

研究证明MLT存在明显的昼夜节律，而且MLT需要与其受体结合才能够发挥生物学效应。通过对MLT影响动物繁殖效应的研究，发现光照周期对MLT的表达与MLTR的分布和表达存在周期性的节律，且MLTR节律具有自主性。Piketty和Pelletier（1993）发现绵羊的垂体结节部/正中隆起中MLTR数量存在日周期性节律变化，从光到暗时最高，最低值出现在夜间结束时，日中值和午夜值则处于中间水平。但是，日周期下，MLTR得亲和力并无显著变化。

Barrett等（1989）证实，MLT可抑制绵羊PT细胞中MLTR1amRNA的合成与积累，并推测可能与MLT抑制cAMP合成有关（Morgan etal.，1989）。然而，Barrett等（1989）发现MLT并不完全消除MLTR1a mRNA水平，故此认为其可能只对转录效率有影响，而不能启动转录过程。

日光照周期和年光照周期对绵羊MLTR存在节律性影响（Pelletier etal.1985)。虽然MLT与MLTR的亲和力方面没有明显的日变化，但是在非繁殖季节，两者最大结合量与PT部的MLTR1a数量均低于繁殖季节。王忻等[10]通过对非繁殖季节绵羊进行光照控制的研究中发现，光照长度能影响下丘脑中MLTR1a基因表达水平，且两者存在显著的负相关。

以上研究表明，日光照周期从光到暗与年光照周期中的短日照可提高垂体和下丘脑部位的MLTR1a表达水平。

3.3MLTR对羊生殖活动的调控

研究发现MLTR不仅存在于胚胎组织（Reppert et al.1995；MacKenzie etal.2002)、下丘脑和垂体（张勇等，2009；郭婷婷等，2010)，而且存在于视网膜、子宫基底膜、胃肠道、中枢神经系统[6]以及外周组织中（Helliwell etal.1994)。Mahle,etal.（1997)通过原位杂交试验发现在雄性动物的附睾中也存在高亲和力的MLTR1a型受体。Clemens etal.（2001)关于大鼠卵巢的研究揭示了激素可调节卵巢MLT高亲和位点表达。张勇（2009)等利用RT-PCR技术研究了蒙古羊成年母羊卵巢组织中MLT受体，发现卵巢确实有MLT受体MLTR1a亚型的mRNA表达，这暗示着MLT可以通过与卵巢上的MLTR1a相结合，直接作用于卵巢，对绵羊的生殖功能产生直接的调节作用。

在绵羊MLTR1a的研究中，Messer等（1997)利用两点连锁分析和微卫星标记方法发现MLTR1a基因存在于绵羊26号染色体。同时，Barrett等（1997)从绵羊的cDNA文库中分离出编码MLTR1a的基因突变型，并将其命名为MLTR1aβ。研究发现在药理学特性及生理学功能方面，MLTR1aβ受体与以前称为MLTR1aα的受体基本相似。李广录等（2008)也通过对实验研究发现绵羊品种出现了3种基因型：AA、AB、BB，且各基因型的构成与绵羊的品种有关[11]。说明了MLTR1a基因多态性的存在。

目前研究普遍证明，改变光照或补充MLT可影响机体特定部位MLTR1a基因的表达量[12～15]。但是，在季节性繁殖与MLTR1a基因多态性的相关性研究方面，Polletier等[16]Notter等[17]认为两者之间具有明显的相关性，而Migaud等[18]研究得到了两者之间相关性不明显的不同结论。为此，Messager等[19]进行了进一步验证试验，其结果与Migaud相似。由此推测：环境或品种可能对这种相关性有一定的影响，或者MLTR1a基因只是对季节性繁殖进行微调，产生主要作用的还有其他的基因。基于MLTR1b和MLTR1a基因结构非常相似[20]，也有些研究者认为MLTR1b基因也对繁殖季节具有一定的作用。

4 MLT对羊生殖活动的影响及应用

4.1MLT对生殖系统的抑制/促进作用

在机体生殖系统中，下丘脑-垂体-性腺轴（HPG)是控制动物机体性激素分泌的重要分支[21]。Lincoln和Maeda、Malpaux等发现只有将MLT微胶囊埋植于下丘脑的中间底侧部和垂体结节部之后，才能导致机体LH分泌增加[22]，FSH、β-内啡肽水平升高[23]和影响PRL的分泌。后来研究发现，MLT主要通过选择性抑制垂体促性腺细胞对GnRH的应答反应来影响机体性腺的分泌功能，参与机体的性成熟和生殖行为。

近年来研究发现，MLT可通过HPG[24]在下丘脑水平上调节GnRH的释放，从而对性腺类固醇激素、FSH、松弛素、LH和抑制素的合成与释放进行调控，进一步影响机体生殖系统功能。同时，也有研究发现，MLT还可与性腺上的受体相结合，对性腺激素的合成与分泌进行直接的调节[25]。使其浓度发生变化，从而实现对大脑、下丘脑和垂体的反馈调节。这说明MLT除了能通过影响下丘脑和垂体对促性腺激素的分泌而间接影响性腺之外，也能直接作用于性腺调节动物生殖。

国内外学者通过测定动物体内MLT的水平、补充外源性MLT或通过改变光照周期等多种方式研究发现：MLT对绵羊、山羊、鹿等短日照动物的生殖系统有促进作用，表现为经MLT处理后，机体LH和血浆孕酮水平均有提高，PRL水平降低，且能使羔羊提前性成熟和成年绵羊繁殖季节提前到来5周左右[26.27.28]。

4.2MLT对季节性发情的影响

绵羊是季节性发情动物，研究发现这种季节性繁殖活动受到MLT的调控[29]。近年来，人工MLT成功合成后，多采用人为改变光照与MLT埋植相结合的方法调节其繁殖的季节性。Kennaway发现夏季每天下午在饲料中添加MLT，可使绵羊发情期提前两个月；Lincoln使用皮下埋植MLT缓释植入物、Nowak和Rodway使用阴道内MLT缓释器均使绵羊繁殖季节提前；法国科学家利用改变光照和埋入MLT相结合的方法，使母羊初情期提早出现,繁殖季节提前6个月。澳大利亚Genielkn公司研制出MLT制剂，通过皮下埋植可使绵羊繁殖季节提前6～7周。国内张海容等通过埋植褪黑素的实验表明：实验组中第一只母羊发情时间比对照组早30 d，发情率比对照组提高40个百分点。

4.3MLT机体繁殖性能的影响

MLT对繁殖性能的影响可以从对生殖细胞、排卵率、胚胎存活率和产羔率四个方面的影响来论述。

4.3.1 M LT对生殖细胞的影响

有研究表明MLT不仅对雄性动物睾丸组织细胞cAMP的合成[30]有影响，而且对雌性动物卵巢功能及体外状态下黄体细胞和卵泡颗粒细胞[31]与甾类合成均有影响。夏银等研究表明，通过控制光照影响MLT水平可使公羊初情期和精细胞生成活动提前，使其遗传进化加快[32、33]。而且补充外源性MLT后，机体睾丸中单倍体与四倍体细胞的数量有明显差异[34]。

4.3.2 MLT对排卵率的影响

Forcada等（1992）和Rondon等（1996）均研究发现，动物在繁殖季节具有较高的排卵率，而在非繁殖季节或者是繁殖季节的结束和开始阶段排卵率较低。有研究报道埋植MLT能够增加排卵率（Haresign，1992），而对同期化母羊进行MLT处理的相关研究认为：MLT处理不是通过改变卵泡发生的周期提高排卵率，而是通过减少中等卵泡和大卵泡的闭锁增加了排卵卵泡的数量（Bister etal.1999）。然而，也有研究得出了相反的结论：无论是在繁殖季节（McEvoy etal.1998）和非繁殖季节（Forcada etal.2006）进行超数排卵时实施MLT处理均未明显诱导排卵率的增加，认为少数FSH注射程序可能利用了所有卵泡相对独立的闭锁机制（McEvoy etal.1998）。无论是繁殖季节还是非繁殖季节，从屠宰羊的卵巢上分离得到的卵母细胞的数量和体外培养（IVM）的成熟率上都没有差异（Rao etal.2002）。Luther et al.（2005）研究表明非繁殖季节对母羊进行MLT埋植没有增加卵母细胞的数量和体外培养成熟率。Abecia et al.（2007）的研究表明MLT对非繁殖季节或繁殖季节从绵羊卵巢分离卵母细胞经体外成熟培养没有提高其成熟率。

4.3.3 MLT对胚胎存活率和产羔率的影响

反刍动物妊娠的开始和维持建立于胚胎对母体系统的信号，母体对妊娠的识别已经被限定为早期妊娠期黄体的退化被阻止的过程。反刍动物黄体溶解机制包括子宫内膜产生的PGF2a和催产素的反馈调节系统。雌二醇和孕酮是子宫功能的主要调节物，二者通过它们的分子受体调节黄体溶解的时间（Meikle etal.2004）。另外，MLT影响黄体对孕酮的分泌已经在绵羊（Durotoye etal.1997）上得以报道，McEvoy et al.（1998）发现，无论给母羊是否进行MLT的处理，胚胎转移、生存均没有不同。但是，Haresign et al.（1992）和Chemineau et al.（1991）发现：非繁殖季节进行MLT处理能够通过提高黄体的功能或降低黄体溶解蛋白机制而提高胚胎的存活率来提高产羔率。而Abecia et al.（2007）给三个品种羊（Rasa Aragonesa，Assaf and Merino）在产羔季节开始时埋植MLT的研究进一步表明：埋植MLT提高了非繁殖季节母羊超数排卵胚胎存活率，明显降低了不能够成活的胚胎细胞（退化的细胞和生长迟缓的细胞）的数量和比例。Scott et al.（2009）研究表明：在配种后的45 d～90 d埋植缓释MLT表明自然繁殖季节外源性的缓释MLT能够提高19％的窝产仔数。

综上所述，有关MLT对绵羊生殖活动的调节作用日益得到研究者的重视，而且在实际生产中得到应用，取得了一定的效果，但绵羊在季节性繁殖过程中MLT与MLTR的时空互作机制仍然需要进一步研究与探索。

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Research on Regulation of Sheep Reproduction with M elatonin

JIANGWei-dong，SHIChang-qing*（Institute of animal science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China）

In recent years,with the developmentofmolecular biology,the research onmelatonin is increasing. It is found thatmelatonin is a neuroendocrine hormone secreted by the pineal gland,whose importance in animal reproduction is gradually being recognized.To provide reference for follow-up study on melatonin and its application in reproduction,this paper reviews the four aspects of relevant study both from home and abroad,including anabolism of melatonin,interaction with light,influence and application in sheep reproduction and the role and regulation of its receptor in sheep reproduction,and illustrates the importance ofmelatonin and its receptor in reproduction.

melatonin;endocrine;melatonin receptor;reproduction regulation;production application

S826

：A

：1003－6377（2016）05－0001-06

国家自然基金项目（31460597）；新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题（HS201401）；塔里木大学校长基金（TDZKCX201401）

蒋维东（1993-），男，硕士研究生，主要从事兽医相关研究。E-mail：972240982@qq.com

石长青（1971-），男，四川人，硕士生导师，副教授，主要从事动物神经内分泌研究。E-mail：scq926@163.com

2016-04-12，

：2016-05-30