不同微生物添加剂组合对甘蔗尾青贮品质影响

■唐振华　王　波　邹彩霞　夏中生　梁　辛　韦升菊　梁贤威

（1.广西壮族自治区水牛研究所，广西南宁530001；2.广西大学动物科技学院，广西南宁530005）



不同微生物添加剂组合对甘蔗尾青贮品质影响

■唐振华1，2王波1，2邹彩霞1夏中生2梁辛1韦升菊1梁贤威1

（1.广西壮族自治区水牛研究所，广西南宁530001；2.广西大学动物科技学院，广西南宁530005）

摘要：为了研究黑曲霉（AN）单独添加和组合热带假丝酵母(CT)、枯草芽孢杆菌(BS)、植物乳杆菌(LAP)以及布氏乳杆菌(LAB)对甘蔗尾青贮品质影响，试验分12组。对照组（C）不添加添加剂；Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅳ组分别添加20 ml/kg鲜重AN、AN+CT+BS、AN+CT+BS+LAP、AN+CT+BS+LAB菌液；Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2组分别在Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1组基础上添加0.5%尿素；Ⅴ1、Ⅴ2、Ⅴ3组分别添加10、20、30 ml/kg鲜重AN+CT+BS+LAP+LAB菌液；Ⅴ4在Ⅴ2基础上添加0.5%尿素。结果显示：①单独添加AN或者联合其它菌对NDF、ADF含量影响不显著；②与对照相比，Ⅳ组乙酸含量显著升高(P<0.05),乳酸含量有所降低，而其他组乳酸含量显著升高（P<0.05）。Ⅳ组有氧稳定性为各组最高；③添加尿素使pH值上升，提高NDF和CP含量，评分有所降低。各微生物添加剂组合处理甘蔗尾青贮效果均达到1级水平，AN的添加对NDF和ADF降低效果有限，含LAB组合有氧稳定性均有所升高。

关键词：甘蔗尾青贮；微生物添加剂；尿素；青贮品质

黑曲霉是一种公认的安全真菌，能够发酵产生丰富的酶系，如果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶等，对提高青贮中粗蛋白(CP)、降低中性洗涤纤维(NDF)等具有重要作用。部分研究也认为一些酵母、曲霉如果能够合理应用，对提高青贮中粗蛋白(CP)、降低中性洗涤纤维(NDF)等具有重要作用。唐嘉微（2012）研究表明黑曲霉产纤维素能力虽然不及绿色木霉等产霉菌，其安全性得到认可并具有较高的糖化能力。部分研究也认为一些酵母、曲霉如果能够合理应用，对提高青贮中粗蛋白(CP)、降低中性洗涤纤维(NDF)等具有重要作用。郑晓玲报道，在甘蔗尾青贮中添加含乳酸菌、光合细菌、放线菌、酵母菌等复合微生物菌制剂（EM）能够有效降低粗纤维（CF），提高粗脂肪、无氮浸出物、可溶性碳水化合物（WSC）含量。Reich研究表明，布氏乳杆菌40788（Lactobacillus buchneri 40788）联合植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、乳片球菌（Pediococ⁃cus acidilactici）等能够提高玉米青贮乙酸和乙醇含量，其中布氏乳杆菌40788联合植物乳杆菌能够提高玉米青贮体外（in vitro）中性洗涤纤维（NDF消化率），布氏乳杆菌40788能够有效提高玉米青贮有氧稳定性。以上研究主要是研究EM菌制剂，不同类型乳酸等对青贮品质、消化率的影响，而关于不同发酵类型乳酸菌联合酵母、黑曲霉等菌类对青贮品质和有氧稳定性综合影响研究较少。因此，本试验以甘蔗尾为青贮材料，研究不同发酵类型乳酸菌联合热带假丝酵母、黑曲霉等对甘蔗尾青贮青贮品质和有氧稳定性的影响。

1　材料与方法

1.1试验材料

青贮原料：新鲜甘蔗尾由广西水牛研究所水牛种畜场提供，采集后进行人工切断，长度为1～4 cm左右。

表1　甘蔗尾原材料营养成分（风干基础）

添加剂：黑曲霉（Aspergillus niger，AN）；热带假丝酵母（Candida tropicalis,CT）；枯草芽孢杆菌（Bacil⁃lus subtilis,BS）；布氏乳杆菌（Lactobasillus buchneri, LAB）；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,LAP）购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。尿素为市购。

培养基：5°Be′麦芽汁用于黑曲霉培养，MRS液体培养基：用于布氏乳杆菌、植物乳杆菌活化和菌液培养。MRS固体培养基：用于布氏乳杆菌、植物乳杆菌涂板计数。

1.2试验方法

1.2.1试验菌种活化及扩培

安瓿管菌种→活化→5%添加量接入液体培养基，黑曲霉、酵母和枯草芽孢杆菌培养温度为30℃，150 r/min摇床培养，布氏乳杆菌、植物乳杆菌培养温度为37℃，静态培养。

酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸菌接种液计数：用涂板对接种液进行计数；黑曲霉计数用所得菌液加入玻璃珠，用振荡器震荡，用纱布过滤获得孢子悬浮液。在用血球计数板计数。

1.2.2试验设计

对照组（C）不添加添加剂；Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅳ组分别添加20 ml/kg鲜重AN、AN+CT+BS、AN+CT+BS+ LAP、AN+CT+BS+LAB菌液；Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2组分别在Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1组基础上添加0.5%尿素；Ⅴ1、Ⅴ2、Ⅴ3组分别添加10、20、30 ml/kg鲜重AN+CT+BS+LAP+ LAB菌液；Ⅴ4在Ⅴ2基础上添加0.5%尿素。

表2　各组微生物添加剂菌落单位和尿素含量

1.2.3青贮制作

将切好的甘蔗尾，每组按计量取菌液用生理盐水稀释至300 ml，均习喷洒到3 kg甘蔗尾，分装到3个2.5 L玻璃封口瓶，密度为0.4 kg/l。对照组取等量生理盐水。再用封口膜进行密封，避光室内青贮40 d。

1.3测定项目及方法

1.3.1常规项目评定

利用张英丽的常规法测定水分、粗蛋白质（CP）、中性洗涤纤维（NDF）含量和酸性洗涤纤维（ADF）含量。

1.3.2pH值及品质项目分析

①样品预处理开瓶后，去除上层部分，每瓶取35 g样品，放入250 ml广口瓶，添加150 ml超纯水，置于4℃冰箱提取24 h。然后通过2层纱布进行过滤，分装滤液，用于pH值、乳酸、氨态氮、挥发性脂肪酸（VFA）测定。剩下的青贮甘蔗尾进行烘干粉碎用于常规营养成分以及可溶性碳水化合（WSC）测定。

②pH值用pH计进行测定，型号为HANNA HI 8424。

③乳酸用试剂盒进行测定，试剂盒厂家为南京建成，货号A019-2。原理以NAD+为氢受体，LDH催化乳酸脱氢产生丙酮酸，使NAD+转化为NADH。其中PMS递氢使NBT还原为紫色呈色物，呈色物的吸光度在530 nm时与乳酸含量呈线性关系。

④氨态氮（NH3-N）采用比色法测定NH3-N采用苯份-次氯酸钠比色法测定（Broderick等，1980）。①取得的滤液5 ml，3 500 r/min离心10 min取上清。用(NH4)2SO4做标准品，采用美国生产的紫外可见分光光度计（PE Lambda 35型),在波长560 nm下比色，依据标准曲线和光密度值计算出NH3-N的浓度。

⑤挥发性脂肪酸（VFA）测定：取0.5 ml①中所得的滤液，加入等体积8.2%偏磷酸，1 3000 r/min下离心10 min，取上清加入内标巴豆酸后，使用Agilent 7890A型气相色谱仪,HP-INNOWAX(19091N-133)毛细管柱,毛细管柱的规格为30 m×0.25 mm×0.25 μm，分析测定上清液中丙酸、乙酸及丁酸的含量。

⑥可溶性碳水化合物（WSC）测定：蒽酮-硫酸比色法测定。在浓硫酸溶液中可溶性糖先脱水为糖醛或经基糖醛,后与蒽酮反应成蓝绿色化合物。其颜色与含糖量成正比,吸收波长640 nm。

⑦干物质回收率（DMR）：

DMR=（开封时青贮原料质量×青贮干物质率）/填装时装入原料质量×原料干物质率

1.3.3有氧稳定性的测定

每组混合取样200 g置于封口袋中，用牙签扎数个小孔，再套上一个宽松不封口的塑料袋，防止交叉污染和减少水分损失，用温度计测定温度变化。样品置于阴暗处，温度变化每8 h记录1次，当青贮物料的温度超过环境温度2℃时为止。

1.4数据处理

试验数据先用EXCEL软件处理，再用SPSS 17.0软件中的ANOVA过程进行单因子方差分析，差异显著性以P<0.05为判断标准，数据均采用平均值±标准差来表示。

2　结果与分析

2.1不同微生物添加剂组合对甘蔗尾青贮pH值、乳酸的影响

表3　不同添加剂对甘蔗尾青贮发酵品质的影响

由表3可以看出，各试验组与对照组相比，pH值都有所增加。其中添加尿素组Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2和Ⅴ4 pH值显著高于对照组（P<0.05）。Ⅰ1、Ⅱ1和Ⅲ1、Ⅲ2与对照组相比青贮中乳酸含量显著增加（P<0.05）。Ⅳ、Ⅴ3乳酸含量显著低于对照组（P<0.05），Ⅴ2、Ⅴ4乳酸含量显著高于对照组（P<0.05）。添加尿素组与未添加尿素组相比，乳酸含量均有所降低，其中Ⅰ2乳酸含量显著低于Ⅰ1（P<0.05），Ⅱ2乳酸含量显著低于Ⅱ1（P<0.05），Ⅲ2乳酸含量显著低于Ⅲ1（P<0.05）。AN+CT+BS+LAP +LAB处理组随着微生物添加剂组合浓度升高，乳酸含量下降，其中Ⅴ3显著低于Ⅴ1。

2.2不同微生物添加剂组合对甘蔗尾青贮有机酸、氨态氮（NH3-N）的影响

由表3可知，AN处理组与对照组相比，黑曲霉（AN）和尿素对青贮中乙酸含量没有影响。AN+CT+ BS处理组使青贮中乙酸含量有所降低，而随着尿素的添加，乙酸含量升高，显著高于对照组(P<0.05)。由AN+CT+BS+LAP处理组可以看出，LAP的添加对青贮乙酸影响不大。而在AN+CT+BS+LAB处理组，随着LAB的添加，青贮中乙酸含量显著高于对照组(P< 0.05)。AN+CT+BS+LP +LAB处理组乙酸含量均高于对照组，其中Ⅴ2显著高于对照组(P<0.05)。尿素添加使Ⅴ4组含量显著高于Ⅴ1、Ⅴ3。在对照组中未检测出丙酸含量，添加尿素的组合Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2和Ⅴ4检测到丙酸存在。对照组中能检测到丁酸含量，含有LAP、LAB且不添加尿素组未能检测出丁酸含量。添加尿素组Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2和Ⅴ4丁酸含量显著高于对照组(P<0.05)。

添加尿素组Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2和Ⅴ4，NH3-N含量显著高于对照组与其他试验组（P<0.05），其中Ⅲ2中NH3-N含量最高，依次为Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅴ4。其他各试验组NH3-N含量也均较对照组高。Ⅳ、Ⅴ组NH3-N浓度显著高于对照组(P<0.05)。

2.3微生物添加剂对甘蔗尾青贮营养价值的影响

表4　不同添加剂对青贮营养成分的影响

由表4可以看出，添加AN和AN+尿素组与对照组相比，对青贮干物质回收率（DMR）影响不大。而AN+CT+BS处理组中Ⅱ2 DMR与对照组相比有所降低。Ⅲ1、Ⅲ2组随着LAP的添加，DMR有所降低，特别是Ⅲ2+尿素组DMR显著低于对照组。Ⅳ组DMR与对照组相比也有所降低，差异不显著（P>0.05）。

Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1比对照组NDF含量低，其中Ⅲ1 NDF含量最低，而Ⅳ组NDF含量显著高于对照组(P<0.05)。含尿素组Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2 NDF含量显著高于对照组。添加尿素组合Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅴ4可溶性碳水化合物（WSC）含量均比对照组高。其中Ⅰ2 WSC含量显著高于对照组（P<0.05）。Ⅲ1 WSC含量较对照组低，差异不显著（P> 0.05）。Ⅳ组WSC含量较对照组高，显著高于Ⅲ1（P< 0.05）。Ⅴ1、Ⅴ2、Ⅴ3、Ⅴ4组WSC含量均较Ⅲ1高。各试验组中，添加尿素组Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅴ4 CP含量显著高于对照组（P<0.05），未添加尿素组中，Ⅲ1组高于对照组，其它组均较对照组低，差异不显著（P>0.05）。

2.4不同添加剂对甘蔗尾青贮有氧稳定性的影响

表5　不同添加剂对甘蔗尾青贮有氧稳定性的影响

由表5可以看出与对照组相比，Ⅱ1、Ⅱ2组有氧稳定性有所降低，Ⅰ1组不受添加剂的影响。Ⅲ1、Ⅲ2组有氧稳定性均低于对照组。Ⅳ组有氧稳定性最高，其中Ⅱ2有氧稳定性是所有组中最低的。Ⅴ1Ⅴ2、Ⅴ3、Ⅴ4组有氧稳定低于Ⅳ组，但Ⅴ2、Ⅴ3均高于对照组。

2.5甘蔗尾青贮质量评定

感官评定根据我国农业部1996年发布的《青贮饲料质量评定标准（试行）》以色泽、质地、气味以及霉变情况进行评定，再根据Kaiser等提出的以乙酸和丁酸含量评价青贮饲料品质的评定标准进行品质等级评定。根据实际开罐情况和表6可知，添加尿素组上层发生霉变严重，因此从气味、色泽上评定效果不好。从表7得出的评定来看，尿素组所得分值也相对较低，其他各组均达到1级水平。

表6　甘蔗尾青贮感官评定

表7　以乙酸和丁酸含量评价青贮饲料品质

3　讨论

3.1黑曲霉组合其他微生物添加剂对甘蔗尾青贮营养成分的影响

植物中大部分碳水化合物以纤维聚合物组成细胞壁存在且不能被乳酸菌发酵，因此许多研究在青贮中添加酶制剂来降低青贮中纤维含量。但Wein⁃berg表明单独添加纤维素酶使没有效果的。Deh⁃ghani利用组合酶（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶）处理玉米秸秆和苜蓿青贮，结果表明组合酶能够降低玉米秸秆NDF含量，而苜蓿NDF却没有受到影响，Kozelov也得出同样结论。而黑曲霉是美国FDA和我国农业部认证的安全菌，能产生高活性纤维素酶、酸性蛋白酶、果胶酶、糖化酶、木聚糖酶等胞外酶。枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一。热带假丝酵母是优良的好氧型饲料酵母，能利用农副产品制成的培养基中的单糖、游离氨基酸等大量合成蛋白质。任付平利用黑曲霉、绿色木霉、枯草芽孢杆菌等对青贮玉米进行处理，发酵周期为30 d，结果表明与对照组相比，干物质、粗蛋白都有所增加，NDF和ADF含量分别降低13.81%和12.67%。而孙文研究表明，啤酒酵母、枯草芽孢杆菌和乳酸菌组合对玉米秸秆青贮营养成分影响不大，结果与本试验一致。

本试验中黑曲霉或黑曲霉组合其他菌种对NDF含量降低与对照组相比影响不大，这也许是因为黑曲霉添加量不够，产生酶活不够，还可能是因为青贮环境不适宜黑曲霉活动。邬敏辰的研究中，黑曲霉突变株DM-1在31℃，自然pH值产酶效果良好。唐嘉徽研究认为黑曲霉在温度28℃，pH值为4.5时产酶效果良好。而试验室温环境低于20℃，因此发酵前期黑曲霉繁殖活动受到很大限制。

3.2不同微生物添加剂对甘蔗尾青贮发酵产物的影响

本试验随着尿素的添加，在发酵初始阶段，pH值接近中性，一些酶类如微生物酶和脲酶能够降解尿素而产生氨，pH值和氨态氮（NH3-N）与对照组相比显著升高。而荣辉等研究认为，尿素的添加降低乳酸，主要是因为尿素添加使pH值升高，为其他杂菌活动提供了条件，与乳酸菌竞争WSC，如果WSC充足，则乳酸产生不受影响。而V组受尿素添加影响很小，原因可能是布氏乳杆菌（LAB）产生乙酸抑制其它菌活动，乳酸菌更有效利用WSC产生乳酸。

本试验中单独添加AN以及AN+CT+BS组合，与对照组相比乳酸含量均显著升高（P<0.5），原因可能是这些菌类在发酵初期快速消耗青贮中残存的氧气，使自身附植的乳酸菌快速代谢产生乳酸，降低pH值，这与郑晓灵、孙文结果一致。而添加AN+CT+BS+LAP组合，乳酸含含量显著升高（P<0.05），添加AN+CT+ BS+LAB组合乳酸含量低于对照组，这主要是因为植物乳杆菌（LAP）为同型发酵乳酸菌，发酵后期成为主导菌群，产生更多的乳酸，而布氏乳杆菌（LAB）为异型发酵乳杆菌，发酵后期成为主导菌群，在产生乳酸同时，还要生成等摩尔（mol）的乙酸，因此含布氏乳杆菌（LAB）的组合乙酸含量都有所升高。而AN+CT+ BS+LAB+LAP组合，在提高乳酸含量的同时，还提高了乙酸含量，这说明布氏乳杆菌（LAB）与植物乳杆菌（LAP）能够共同起作用。但是当添加菌种组合浓度升高时，乳酸含量明显降低，这也许是因为甘蔗尾自身所附着的乳酸菌为同型发酵乳酸菌，当菌种组合浓度升高时，布氏乳杆菌（LAB）作用就越来越明显，产生更多异型发酵。

3.3不同添加剂对甘蔗尾青贮有氧稳定性的影响

试验中无论单独添加布氏乳杆菌（LAB）还是联合其他菌种，都能提高甘蔗尾青贮有氧稳定性，Holzer等早时期研究异型发酵乳杆菌代谢过程产生的物质对青贮有氧稳定性的作用，结果发现乙酸是影响有氧稳定性的唯一参数。因此，许多研究都表明布氏乳杆菌（LAB）对青贮有稳定性有改善作用。但是，Tabac⁃co的研究中，各处理乙酸含量差异不显著，而有氧稳定性却有差异，因此Tabacco认为青贮有氧稳定性不仅与乙酸含量相关，还与DM、pH值等负相关。

3.4甘蔗尾青贮质量评定研究

感官评定的参照标准是以我国农业部1996年发布的《青贮饲料质量评定标准（试行）》中玉米秸秆的标准为参考，因此该参考有很大的局限性，因为甘蔗尾青贮在气味、色泽、质地等方面与玉米秸秆具有一定的差异性。而Kaiser等提出的以乙酸和丁酸含量评价青贮饲料品质的评定标准，不考虑氨态氮、pH值以及乳酸，因为氨态氮、pH值不仅与青贮发酵过程有关，还与青贮牧草种类、及化学成分有关。而乳酸含量与乳酸菌发酵类型相关，同型发酵乳酸菌能产生更多乳酸，但有氧稳定性低，异型发酵乳酸菌产生乳酸含量低，虽然造成营养物质损失较高，但有氧稳定性高。

试验中尿素添加使青贮感官评定较差，上层发霉明显，原因可能是尿素使甘蔗尾青贮缓冲度上升，pH值升高，梭菌等有害菌活动加强，造成青贮丁酸含量上升，降低青贮品质。这与荣辉等研究尿素对象草青贮发酵品质影响的结果一致。而Yunus就曾表明，发酵初期，pH值接近中性，微生物酶、植酸酶和脲酶分解尿素成氨，提高缓冲能值。因此试验中添加尿素组pH值在5.0以上，为脲酶活动提供了有利条件。在此pH值下，非常利于梭菌活动，使青贮丁酸含量上升，降低青贮品质。

4　结论

①与对照组相比，试验组黑曲霉单独或混合其他菌种添处理甘蔗尾青贮对NDF降解效果不显著，其中尿素以及布氏乳杆菌的添加反而使NDF含量较对照组高。

②添加尿素虽然增加青贮CP含量，但是青贮品质有所降低，感官评定和青贮等级有所下降。

参考文献（21篇，刊略，需者可函索）

（编辑：王芳，xfang2005@163.com）

Effect of microbial inoculants on quality of sugarcane tops silage

Tang Zhenhua, Wang Bo, Zou Caixia, Xia Zhongsheng, Liang Xin, Wei Shengju, Liang Xianwei

Abstract：This trial were conducted to investigate the effects of Aspergillus niger or combine with Can⁃dida tropicalis, Bacillus subtilis, Lactobasillus buchneri, Lactobacillus plantarum on quality of sugar⁃cane tops silage. The 12 additive treatments were: Silages with no additives served as control；GroupⅠ1,Ⅱ1,Ⅲ1,Ⅳwere treated with AN, AN+CT+BS, AN+CT+BS+LAP, AN+CT+BS+LAB at 20 ml/kg re⁃spectively; GroupⅠ2,Ⅱ2,Ⅲ2 were treated with 0.5% urea at the basic ofⅠ1,Ⅱ1,Ⅲ1 respectively; GroupⅤ1,Ⅴ2,Ⅴ3 were treated with 10, 20, 30 ml/kg AN+CT+BS+LAP+LAB respectively,Ⅴ4 were treated with 0.5% urea at the basic ofⅤ2.①There are no effect of AN or combine with other inocu⁃lant on levels of NDF and ADF applying to sugarcane tops silage;②Compare to control, the concentra⁃tion of acetic acid increased significantly(P<0.05), the concentration of lactic acid decreased significant⁃ly(P<0.05) while others groups increased significantly(P<0.05);③Treated with 0.5% urea had signifi⁃cantly higher levels of pH, DNF, CP. The grade of evalution for the quality of silage were grade 1 in all groups, and there are no effect of AN on levels of NDF and ADF applying to sugarcane tops silage, the aerobic stability of sugarcane tops silage were improved treated with microbial inoculants contain LAB.

Key words：sugarcane tops silage；microbial inoculants；urea；quality

基金项目：广西自然科学基金[2015GXNSFAA139065]和广西水产畜牧兽医局科研计划项目[桂渔牧科1304514]

收稿日期：2015-10-03

通讯作者：邹彩霞，研究员，硕士生导师。

作者简介：唐振华，硕士，主要从事反刍动物营养研究。

中图分类号：S816.32

文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2016）01-0032-06

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.01.007