贾 建,曹荣安,*,杜亿华,赵泽龙,李良玉
(1.黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163319;2.北京工商大学食品学院,北京 100048;3.黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心,黑龙江大庆 163319)
板蓝根多糖研究进展
贾建1,曹荣安1,*,杜亿华2,赵泽龙1,李良玉3
(1.黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163319;2.北京工商大学食品学院,北京 100048;3.黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心,黑龙江大庆 163319)
板蓝根为中国传统中药,板蓝根多糖是板蓝根中含量较多的化学成分之一。目前国内外有很多关于板蓝根多糖的研究报道,随着研究的深入,人们也逐渐意识到板蓝根多糖可能是板蓝根生物活性的主要作用因子之一。本文对板蓝根多糖的国内外研究情况进行系统的归纳和总结,分别介绍了板蓝根多糖的提取与纯化方法、分子量、单糖组成、结构、生物活性和板蓝根多糖保健品研究进展情况,希望为板蓝根多糖今后的研究提供一定的借鉴,也相信板蓝根多糖在未来一定有更加广泛的发展和应用空间。
板蓝根,多糖,研究进展
板蓝根为中国传统中药,《中华人民共和国药典》规定其为十字花科植物菘蓝(IsatisindigoticaFort.)的干燥根,菘蓝为全国多数地区习惯应用,称为“北板蓝”;西南和华南地区习惯应用马蓝,称为“南板蓝”。板蓝根始载于《神农本草经》,有清热解毒、凉血利咽功能[1]。现代研究也证明,板蓝根具有抑菌[2]、抗病毒[3-4]、抗癌[5]、抗炎[6]、镇痛[7]、退热[8]等功效,并且临床上常用于病毒性疾病及细菌性感染疾病的治疗,同时板蓝根的药理活性及有效成分也得到了深入的研究。板蓝根多糖是板蓝根中主要化学成分和生物活性的主要作用因子之一,目前国内外有很多关于板蓝根多糖的研究报道。本文对板蓝根多糖(主要为北板蓝根)的研究现状进行系统的归纳和总结,希望能够对板蓝根多糖的研究与利用起到借鉴作用。
1.1板蓝根多糖的提取
多糖作为生物大分子,在热水中溶解度较大,所以目前大多采用水提醇沉法进行板蓝根多糖的提取,即板蓝根脱脂后加入一定量热水经多次回流收集提取液,浓缩后加入乙醇使多糖以沉淀形式析出。很多研究人员对板蓝根多糖的提取进行了研究,但由于板蓝根原料产地的不同,前处理方法以及设备条件的差别,得到了不同的提取参数。板蓝根的脱脂可以采用乙醇和乙醚混合溶液,提取温度为100 ℃、料液比1∶20(g/mL)、醇沉比例为80%时四倍体板蓝根根部多糖的提取率为3.08%[9]。浸提温度100 ℃、浸提时间7 h条件下板蓝根多糖提取率为27.5%[10-11],料液比1∶30、提取温度90 ℃、提取时间6 h时得率为25.63%[12],而当料液比为1∶24时多糖提取率仅为11.92%[13],同时提取温度会影响板蓝根多糖的分子量和单糖组成[14]。
水提醇沉法提取板蓝根多糖操作简单,便于工业生产,但是也存在提取温度高、时间长、能耗大、提取率较低的缺点。随着提取技术的不断发展进步,很多新的技术也应用到板蓝根多糖的提取中,例如微波辅助、超声波辅助和酶法辅助提取。运用微波技术提取板蓝根多糖反应时间缩短12倍,多糖含量由0.81%提高到3.47%[15],当料液比1∶40、提取时间8 min、微波功率500 W,多糖提取率为6.55%[16],如果水浸泡1 h后再微波处理,多糖得率可达33.06%[17]。超声功率149.8 W、超声时间30.5 min、料水比1∶30.2时多糖的提取率为15.52%[18],也可以采用40 ℃、100 W、30 min的参数提取板蓝根多糖[19]。在纤维素酶2.0%、果胶酶1.0%、胰蛋白酶2.0%、50 ℃、pH5、70 min条件下板蓝根多糖得率达到20.34%[20]。
从以上可以看出微波和超声波辅助提取具有快速、安全、高效、节能等特点,酶法的优点是提取时间短、条件温和、无污染等,与微波和超声波辅助法相比也不要求特殊设备。但同时也存在各自的不足,例如微波和超声波功率及处理时间对多糖提取效果和活性影响较复杂,大功率长时间提取会造成溶液中水分快速蒸发,使板蓝根中的粘液质、淀粉等物质溶出,使提取液的粘度增大,多糖成分不易提取、有效成分变性。再者微波法在提取过程中的热效应很有可能破坏板蓝根多糖等大分子物质的结构,功率太小则不足以提供足够的摩擦热使胞内水分汽化而实现微波破壁,提取率提高[16,21]。酶对反应条件要求较高,在设计提取工艺时既要考虑各种酶类合适的反应条件,又要确保多糖高效提取。三种辅助提取的方法目前仅限于实验室规模的研究应用,而且研究的指标仅是其对于板蓝根多糖提取率的影响,没有关于多糖生物活性和分子量影响的研究,所以还不适合工业生产,有待于进一步研究,在实际应用中也要根据不同的原料和条件选择适宜的提取方法和提取温度,同时要防止在提取过程中所用的试剂和温度等条件对板蓝根多糖的破坏。
1.2板蓝根多糖的纯化
提取分离后的板蓝根多糖含有多种杂质,包括蛋白质、色素、低分子质量成分,从而需要进行纯化、分级。在板蓝根脱蛋白研究方面,可以采用胃/胰蛋白酶在一定条件下脱蛋白[22],也可以采用三氯乙酸和Sevag法进行脱蛋白[23-24],尤其是采用三氯乙酸法脱蛋白效果最好[12],采用D152型阳离子交换树脂能有效脱除板蓝根粗多糖中色素[25]。可以利用乙醇分级沉淀、Sephadex G75、Sephadex G100、Sephadex G200、DEAE纤维素离子交换层析柱进行板蓝根多糖的分离纯化[26-28],同时冻融-酶解-膜分离复合技术也可用于板蓝根多糖的纯化[29]。
在板蓝根多糖经过提取纯化后,很多研究者也对其分子量进行了测定,由于提取纯化以及测定方法的不同得到的板蓝根多糖分子量也就有所不同。有很多研究者采用的是高效凝胶渗透色谱法测定板蓝根多糖分子量,陈浩然等测定的板蓝根多糖的相对分子量为11700[26],何立巍等测定纯化后的五个板蓝根多糖的平均相对分子质量分别为>2000、1757.1、1342.7、955.6、11.7 u[27],马莉等测定的四种均一板蓝根多糖相对分子质量分别为1.2×104、2.6×104、4.2×103、2.5×103[28]。同时也可以采用高效凝胶色谱-蒸发光散射检测器(HPGFC-ELSD)或HPLC-ELSD进行板蓝多糖分子量的测定[30-32],采用其它方法测定的板蓝根多糖分子量也不尽相同[23,33-35]。
对于板蓝根多糖的单糖组成,很多的研究者采用了不同的方法进行了分析研究,分析得到的板蓝根多糖的单糖组成也各不相同。板蓝根多糖水解后在硅胶G板上展开,HPLC检测主要单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖[26-27]和鼠李糖[36],而经过乙酰化后利用气相色谱分析单糖组成为鼠李糖、果糖、葡萄糖和半乳糖[23],而经过柱前衍后用毛细管区带电泳法测定板蓝根多糖的单糖组成为木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖[24]。吴慧平对板蓝根多糖纯化后得到两种多糖组分,经UV、IR、TLC、GC分析,多糖为含肽多糖,一种由鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶乳糖∶葡萄糖(0.09∶0.35∶0.02∶0.71∶1.0∶1.77)六种单糖组成,糖苷键为α-型;另一种由鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖(0.85∶1.93∶0.16∶0.34∶1.0∶1.48)六种单糖组成,糖苷键为β-型[33]。陈谦经过PC及GC分析证明其得到的一种板蓝根多糖为葡聚糖,不含糖醛酸,另一种则含鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖及葡萄糖醛酸[35],同时也存在半乳糖醛酸[37]。
目前对于板蓝根多糖结构的研究报道较少,已有的研究均认为糖苷键构型以α为主。陈浩然等经UV、IR、NMR和高碘酸氧化、Smith降解法研究板蓝根多糖的化学结构,认为其糖苷键构型以α为主,连接方式以1→3键连接为主,并同时存在1→2和(或)1→4的连接方式[26]。红外光谱分析表明板蓝根单糖以吡喃糖苷的形式存在,含有α-糖苷键[23],存在1→2、1→3、1→4、1→6多种糖苷键的连接方式[27]。陈谦研究认为板蓝根多糖是D-葡萄糖残基以α(1→4)连接为主链,在3位、6位有分支,重复单元为9个葡萄糖残基的葡聚糖[35]。
5.1抗氧化
板蓝根多糖具有清除ABTS+自由基能力,清除率达75.2%,对羟基自由基清除率达90%以上[10,38]。在羟基自由基体系中菘蓝根多糖显示较强的清除作用,清除率为52.60%,草大青根和马蓝根多糖最高分别可达到41.29%、39.35%;在超氧阴离子自由基体系中,菘蓝根多糖、草大青根和马蓝根多糖的清除率最高分别可达到50.00%、39.75%、39.15%;在DPPH自由基体系中,3种多糖最高清除率为42.75%[39]。朱道玉系统研究了板蓝根多糖对中华鳖脑、肾脏、肝脏、小肠超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量的影响,结果表明剂量较低时能显著提高脑SOD、CAT活性,剂量较高时能显著提高鳖脑SOD、GSH-Px活性;对肾脏SOD酶活性影响不显著,但能显著提高GSH-PX酶活性;能提高肝脏SOD、CAT、GSH-PX的活性,降低MDA的含量;显著提高小肠SOD、GSH-PX酶活性,极显著降低MDA含量,而且小肠SOD活性随注射剂量的增大而增强,MDA含量随注射剂量的增大而降低。对于板蓝根多糖提高抗氧化酶活性,降低脂质过氧化的机理还有待进一步深入研究[40-43]。
5.2抑菌和抗病毒
板蓝根多糖能够通过增强抗体的产生,调节细胞因子的释放,增强宿主的体液免疫和细胞免疫功能,保护宿主抵抗胞内菌的感染,从而对鼠伤寒杆菌、大肠埃希菌、链球菌、金黄色葡萄球菌和支原体具有一定的抑制作用[44-45]。板蓝根多糖通过提高T细胞分泌TH2型细胞因子IL-10的产量,促进B细胞分化成抗体,产生体液免疫作用;同时,板蓝根多糖还能提高小鼠NK细胞的活性,增强NK细胞对病毒的吞噬能力[32],其抗感染和免疫调节作用可能与人-β防御素-2基因诱导表达上调有关[46]。板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征病毒具有较好的阻断和抑制作用,可以作为免疫增强剂与PRRSV弱毒苗联合使用[47-51],还具有抗鹅细小病毒和单纯疱疹病毒Ⅱ型感染的作用[52-54],对于治疗亚临床型尖锐湿疣也具有良好的效果[55]。板蓝根多糖也可以提高鸡的免疫力,对鸡新城疫疫苗的免疫效果有明显的增强作用[56-58],分析认为其能促进实验动物非特异性免疫、增强体液的免疫功能,并参与了调节细胞的免疫功能,从而提高了动物抵抗流感病毒感染的能力[59-60]。吴灵威研究发现板蓝根主要通过其多糖组分,协同其蛋白组分,作用于细胞膜表面的唾液酸,与流感病毒产生竞争性吸附,以包被的方式保护细胞,有效预防了流感病毒对细胞的侵害,从而达到抗病毒的目的[61]。
5.3免疫活性
很多研究者通过体内外实验对板蓝根多糖的免疫活性进行了广泛的研究,取得了很多的研究成果。在体外实验中研究了板蓝根多糖对于各种细胞的影响,其可以提高淋巴细胞NO、IFN-γ、IL-10的分泌以及IL-4和IFN-γ细胞因子mRNA的表达[38,62-63],对内毒素诱导的人THP-1多种炎症因子表达有调节作用[64],从而对鹅胚成纤维细胞和小鼠脾淋巴细胞有增殖作用[28,65],可显著促进小鼠免疫疫功能[31,44,66-68]。同时板蓝根多糖能明显协同ConA刺激淋巴细胞增殖,而且引起鸡脾脏淋巴细胞蛋白激酶c活性明显升高[69-70]。Qiu等研究表明板蓝根多糖可以提高接种疫苗后小鸡的血清抗体产量和T淋巴细胞的增殖,可以提高细胞和体液免疫[71]。赵珊珊等研究表明板蓝根多糖可以促进无初乳仔鼠十二指肠黏膜IgG+和 SIgA+细胞的表达,常乳中板蓝根多糖在一定程度上对仔鼠黏膜免疫的影响效果等于或高于用初乳喂养的仔鼠[72]。对于板蓝根多糖对实验小鼠是否有毒副作用有不同的争论,王宏艳等研究表明在一定浓度范围内板蓝根多糖对小白鼠机体无明显毒副作用[73],耿婵娟等研究证明板蓝根粗多糖能提升小鼠免疫功能的同时对小鼠的发育有一定影响[74]。
5.4抗炎症
板蓝根多糖(IIP)对内毒素诱导的人单核/巨噬细胞多种炎症因子表达有调节作用,IIP+LPS组中IL-1β、IL-8、TIMP-2的表达增强,与LPS组比较,IIP+LPS组的IL-1β、IL-6的表达降低,TIMP-2蛋白升高[75]。通过体外实验表明板蓝根多糖可降低LPS刺激J744.a.1小鼠巨噬细胞株引起的NF-кB与DNA的结合活性升高,但同时对于板蓝根多糖降低NF-кB结合活性的作用机理尚待进一步研究[33]。
5.5改善肠道微环境
张书松等研究表明板蓝根多糖可以促进小鼠小肠发育,对小鼠小肠形态发育效果明显的板蓝根多糖的最佳剂量为10 mg/kg,同时使用PK-15细胞进行了黏附实验及黏附抑制实验,结果表明板蓝根多糖对致病性大肠埃希菌的细胞黏附具有抑制作用,提示该多糖具有调节肠道微生态的潜在应用价值[76-77]。
5.6抗肿瘤
赵从凯等研究表明200、400、800 mg/15 mL三种浓度的板蓝根多糖溶液对S180肉瘤的抑制率分别为19.35%、78.54%和67.85%,板蓝根多糖浓度为400 mg/15 mL时可显著提高昆明种小鼠的体液免疫和细胞免疫。另外,研究还发现服用板蓝根多糖的小鼠其体重比对照组略有增加,说明板蓝根多糖对小鼠副作用很小或无副作用[78]。
5.7保肝、降血脂
苏辉等探讨板蓝根多糖对自体肝移植大鼠缺血再灌注损伤的作用,结果表明应用板蓝根多糖处理后的肝实质损伤明显降低,转氨酶升高水平较单纯自体肝移植组低,于术后1 h达峰后即迅速下降,TNF-α水平升高不明显,表明板蓝根多糖对肝功能及肝细胞损伤具有明显的保护作用[79]。板蓝根多糖对高脂模型大鼠的降血脂作用实验结果表明其具有降血脂作用,且高剂量效果更显著[80]。
刘志明等以板蓝根为原料,在一定条件下泡制白酒,制得板蓝根多糖保健酒,也研制了板蓝根多糖胶冻,在板蓝根多糖提取液(18.9 mg/mL)与卡拉胶溶液(20 mg/mL)体积比3∶7、绵白糖加量30 mg/mL、果汁粉加量45 mg/mL、柠檬酸加量0.6 mg/mL时口感最佳,板蓝根多糖胶冻冻体均匀、色美味佳,其内聚性、黏附性、胶黏性、咀嚼性、弹性和硬度等力学性质能很好地满足食用需要[81-82]。
目前对于板蓝根多糖的研究已经取得了一定的成果,但是由于原料产地和提取方法的不同导致板蓝根多糖的分子量、单糖组成和生物活性也就有所不同,这就限制了对其进一步的药理研究和大规模标准化生产应用。今后对于板蓝根多糖的研究首先应该纯化得到含量为95%以上的板蓝根多糖,因为只有最终多糖含量(注意不是总糖含量)达95%以上[83],通过生物活性研究证明其确实有效,这才能肯定有效成分是板蓝根多糖,而目前很多对于板蓝根多糖的研究大多是粗提物,多糖含量低,很有可能是板蓝根中的其它物质在起到相应的活性作用。第二是明晰板蓝根多糖的生物活性机理,因为至今尚无确切的实验依据证实大分子多糖能够被吸收进入体内,那么对于板蓝根的多糖其作用是在肠道中水解后的片段进入体内发挥作用,还是作用于肠道的某些受体再在体内产生相关内源性因子发挥作用,这些都需要进一步的研究[84]。第三是需要明确板蓝根多糖的构效关系,这就需要对其结构进行明确的表征,为生物活性研究和应用提供理解依据。总之随着多糖研究方法和技术的不断进步,相信板蓝根多糖的研究会更加的深入和透彻,其应用前景也会更加的广阔。
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Review of the researches on polysaccharides fromIsatisindigaticaFort.
JIA Jian1,CAO Rong-an1,*,DU Yi-hua2,ZHAO Ze-long1,LI Liang-yu3
(1.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.College of Food Science,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China;3.National Coarse Cereals Engineering Research Center,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China)
IsatisindigaticaFort. is a known traditional Chinese herb with the polysaccharides as one of the main components. The polysaccharides were found to be one of the factors for the bioactivities ofIsatisindigaticaFort. according to the researches. This paper reviewed the publications about the polysaccharides fromIsatisindigaticaFort.,including the extraction and purification methods,monosaccharide composition,molecular weight,glycosidic bond,immunomodulatory activities and functional foods. This review may promote the researches on the polysaccharides from theIsatisindigaticaFort.. And the polysaccharides from theIsatisindigaticaFort. will surely be used widely in the future.
IsatisindigaticaFort.;polysaccharides;review
2016-01-20
贾建(1971-),男,硕士,高级实验师,研究方向:生物活性天然产物,E-mail:jiajian710513@126.com。
曹荣安(1980-),男,博士,讲师,研究方向:生物活性天然产物,E-mail:racao@163.com。
黑龙江八一农垦大学2014年度校内培育课题(XZR2014-08);2015年黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(201510223010);黑龙江八一农垦大学学成、引进人才科研启动计划(XDB2015-30)。
TS201.1
A
1002-0306(2016)18-0378-06
10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.064