加工番茄Tm-22基因的SCAR鉴定

孙秀霞，于 超，赖黎丽，李守明，曾沂辉，薛 琳

(新疆石河子蔬菜研究所，新疆石河子 832000)



加工番茄Tm-22基因的SCAR鉴定

孙秀霞，于 超，赖黎丽，李守明，曾沂辉，薛 琳

(新疆石河子蔬菜研究所，新疆石河子 832000)

摘要：【目的】建立利用SCAR标记技术鉴定番茄花叶病毒病抗性基因Tm-22的技术体系，开展分子标记辅助选择育种，选育加工番茄抗病品种。【方法】以6份ToMV表现型鉴定已知的加工番茄材料为试材，选用与Tm-22基因连锁的SCAR标记，通过PCR扩增和Hind III酶切鉴定有无Tm-22基因，并将其应用于加工番茄品种选育。【结果】抗感试材均产生950 bp和1 100 bp的特异片段，纯合抗病基因型无Hind III酶切位点，杂合抗病基因型和感病基因型有Hind III酶切位点，酶切结果为：纯合抗病1 100 bp+950 bp、杂合抗病1 100 bp+950 bp+500 bp+300 bp+150 bp、感病基因1 100 bp+500 bp+300 bp+150 bp。【结论】通过酶切产生的特异性片段就可鉴定出Tm-22基因，成本低，操作不受时间、地域、发育时期的限制，提高了选择的准确性，加快了育种进程。

关键词：SCAR标记；加工番茄；Tm-22基因；分子标记辅助选择

0引 言

【研究意义】加工番茄(Solanumlycopersicum)原产自南美洲西部太平洋沿岸，因其风味独特、富含多种维生素及矿物质、番茄红素含量高、适应性广、产量高等特点，已发展成为世界范围内广泛种植的蔬菜之一，在世界农业经济和农业市场中占有重要的地位[1]。新疆具有得天独厚的资源优势和生态条件，已成为全球加工番茄种植和加工的三大中心之一，番茄生产能力占到全国的90%以上[2]，加工番茄产业已成为新疆的特色型“红色”支柱产业和创汇产业[3-4]。随着种植面积和规模的不断扩大，连作年限延长，以番茄花叶病毒(Tomato Mosaic Virus, ToMV)为主的病毒病频繁爆发，常造成品质下降，产量锐减，甚至绝收，危害十分严重[5-6]。培育和推广抗病品种是防御病害最安全、经济、有效的途径，通过分析与抗病基因紧密连锁的分子标记来判断抗病基因是否存在，可以大大加速抗病基因的转移和利用，从而提高抗病育种的效率。【前人研究进展】植物抗病育种依赖于抗病基因的鉴定和利用，目前已鉴定出番茄花叶病毒病的3个显性抗病基因Tm-1、Tm-2和Tm-22(或Tm-2a)，其中Tm-22基因对不同株系均表现高抗性[7]。国内外学者已在番茄中发现了多个与Tm-22基因连锁的分子标记并应用于辅助育种[8-12]，但在加工番茄中鲜有报道。【本研究切入点】基于加工番茄中Tm-22基因的鉴定及分子标记辅助选择研究报道较少，建立利用序列特异性扩增区域(sequence characterized amplified region，SCAR)标记筛选Tm-22基因的技术体系并应用于加工番茄的品种选育，加快抗病育种进程。【拟解决的关键问题】利用与抗病基因紧密连锁的SCAR标记进行Tm-22基因的鉴定与辅助选择，为番茄花叶病毒病的分子辅助育种、抗性基因精细定位及多基因聚合育种等研究奠定基础。

1材料与方法

1.1　材 料

所用加工番茄材料共6份，均由新疆石河子蔬菜研究所提供，其中4份材料通过传统方法鉴定为ToMV抗病，其余2份被鉴定为ToMV感病。YF08(EFS，SSC≥6%，LERCOPERION CONTENT≥15 mg/100 g)是高代加工番茄自交系，用于配置杂交组合。Tm-22基因的SCAR标记引物参照Dax[13]等设计，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。表1，表2

表1材料的抗病性及SCAR标记扩增的特异性片段
Table l The disease resistance of the materials and the specific fragments amplified by SCAR markers

编号No.材料Material抗病性DiseaseResistance扩增产物Amplifiedproducts(bp)HindⅢ酶切结果(bp)DigestedproductsbyHindⅢ1LM43感病950、11001100、500、300、1502ES29感病950、11001100、500、300、1503TJ31抗病950、11001100、500、300、1504LP17抗病950、11001100、950、500、300、1505GF35抗病950、11001100、950、500、300、1506TX24抗病950、11001100、950

表2引物信息
Table 2 The information of the primers

引物名称Primername引物序列Primersequence(5’→3')片断长度Fragmentlength(bp)SCARFCACCTTTCCCTCTCCAASCARRCACCTTTCCCCTAAAGC950、1100

1.2　 方 法

1.2.1 基因组DNA的提取

取离心管盖大小、还未展开的嫩叶0.1 g左右，参照Hemming等[14]利用改良的CTAB法提取基因组DNA，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃保存备用。

1.2.2 SCAR扩增及产物检测

反应总体系25 μL，包含Buffer 2.5 μL、dNTPs 0.1 mmol/L、Mg2+1.5 mmol/L、引物0.2 μmol/L、TaqDNA聚台酶1 U、模板DNA 20 ng，终体积用水加至25 μL。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1min，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电压5 V/cm条件下电泳2 h，EB替代物染色，GelDoc-it2凝胶成像系统拍照。

1.2.3 酶 切

Tm-22基因的SCAR标记为共显性，其PCR产物需要酶切[13]，酶切体系为扩增产物7 μL，5 U的HindIII，最终用Buffer加至终体积10 μL。反应体系在37 ℃保温4 h，结果用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，电压5 V/cm条件下电泳2 h，EB替代物染色，GelDoc-it2凝胶成像系统拍照。

1.2.4 分子标记辅助选择育种技术的应用

选取鉴定结果为Tm-22基因纯和的加工番茄材料做父本，以综合性状优良的自交系YF08为母本配置杂交组合，利用建立的SCAR标记技术体系，对其F2代单株进行Tm-22基因的筛选。

2 结果与分析

2.1　Tm-22基因的SCAR标记

利用SCAR正反引物对全部试材扩增，结果表明无论是抗病材料还是感病材料均扩增出了950 bp和1 100 bp的特异性片段(图1 A)。经HindIII酶切后，感病材料的950 bp条带被切开产生约500、300和150 bp的三条带(图1 B 1和2)。抗病材料出现两种酶切结果：950 bp条带被不完全切开，产生约950、500、300和150 bp四条带(图1 B 4和5)；950 bp条带未被切开(图1 B 6)。参照陈丽静[11]、李君明[12]等的研究结果可得出，在抗病材料中，950 bp条带被不完全切开的是杂合抗病基因型，950 bp条带未被切开的是纯和抗病基因型。图1

2.2　 SCAR标记对传统鉴定结果的验证

将SCAR标记的鉴定结果与田间抗病性表现进行比对，结果显示，材料TJ31的标记鉴定结果(感病)(图1 B 3)与其田间抗病性表现(抗病)不符。导致这种现象发生的原因，除去基因之间可能产生的交换重组外，还应考虑到接种发病情况和抗病调查标准等。图1

图1 SCAR引物扩增产物(A)和HindIII酶切结果(B)
Fig.1The products amplifiedby SCAR primer(A)and digested byHindⅢ enzyme(B)

2.3　 SCAR标记技术在加工番茄育种中的应用

根据酶切产生的特异性片段，选取鉴定结果为纯和抗病基因型的TX24做父本，以综合性状优良的自交系YF08为母本配置杂交组合。利用建立的SCAR标记技术对其F2代单株进行鉴定，所有材料均扩增出了950 bp和1 100 bp的特异性片段。经HindIII酶切后，出现三种结果：(1)950 bp条带被切开产生约500 bp、300 bp和150 bp的三条带(图2 B 1~3、7~15)，即感病基因型；(2)950 bp条带被不完全切开，产生约950、500、300和150 bp四条带(图2 B4、16和18)，即杂合抗病基因型；(3)950 bp条带未被切开(图2 B5、6和17)，即纯和抗病基因型。图2

图2 部分F2代单株的SCAR扩增产物(A)和HindIII酶切结果(B)
Fig.2The SCAR amplification (A)and caps products (B) of the partial F2individuals

3 讨 论

病毒病是加工番茄生产中的主要病害之一。近年来，随着加工番茄的大面积种植和连续种植，连作和重茬增多，病毒病害也日趋严重，一旦爆发，常造成产量锐减，甚至绝收。在我国其主要病原为番茄花叶病毒，因药剂难以防治，抗病毒育种受到高度重视[15]。传统的表型鉴定和人工接种抗病性鉴定程序烦琐、耗时、耗力，还因受环境条件、人为鉴定标准的差异造成鉴定结果不稳定，延长育种周期。DNA分子标记技术的发展为解决以上问题带来了契机，它能从DNA水平上鉴定抗病位点，不受时间、地域的限制，提高了选择效率，加速了育种工作进程，为早期抗病基因快速筛选鉴定提供了一项有力手段。研究利用与ToMV抗性基因Tm-22紧密连锁的SCAR标记[13]，通过PCR扩增和酶切结果来鉴定抗性基因的有无。参照前人研究结果可以得出，纯和抗病基因型无HindIII酶切位点，酶切结果为：1 100 bp+950 bp；杂合抗病基因型和感病基因型有HindIII酶切位点，酶切结果为：杂合抗病1 100 bp+950 bp+500 bp+300 bp+150 bp、感病基因1 100 bp+500 bp+300 bp+150 bp。酶切结果与李君明等[12-13]有一定的差异，其原因可能是与所使用的Marker、电泳时间及PCR扩增体系、酶切条件不同有关。研究经多次实验和不同材料验证，结果稳定可靠，可用于Tm-22基因的鉴定。

分子标记辅助选择的前提条件是筛选到与目标性状紧密连锁的分子标记， 一经确定与某一目标性状紧密连锁的分子标记，就可以在分离群体的早代、植株发育的早期，甚至在一个生长季进行多次选择，可显著加快育种速度。在众多分子标记中，SCAR因其具有快速、简便、重复性好、成本低、适用于样品的大量分析等优点，在标记辅助选择实践中最易成为与具体性状连锁并能自动化的首选标记[16]，在分子标记辅助选择领域得到广泛应用[17-18]。研究筛选的SCAR标记，在不同研究报道中，因所使用的Marker、电泳时间及PCR扩增体系、酶切条件不同会造成酶切产物不同，但其核心本质都在于950 bp的条带能否被切开。即：950 bp的条带不被切开，材料被鉴定为纯和抗病基因型；950 bp的条带被不完全切开，材料被鉴定为杂合抗病基因型；950 bp的条带被完全切开，材料被鉴定为纯和感病基因型。根据950 bp条带的酶切结果，就可在F2代单株筛选Tm-22基因，配合使用花药培养技术和组织培养技术，就可加快育种材料纯和的研究与应用。

4 结 论

建立了利用SCAR标记技术鉴定ToMV抗性基因Tm-22的技术体系，通过酶切产生的特异性片段来鉴别材料的基因型，并将其应用于加工番茄的辅助选择育种，结果稳定、可靠，提高了选择的准确性，加快了育种进程，对加工番茄抗病品种的选育具有重要的理论意义和实践价值。

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Fund project:Supported by National Science and Technology Supporting Program (2012BAD02B04), the Special Fund for Youth Scientific and Technological Innovation of XPCC (2013CB007), Agricultural Science and Technology Program for Tackling Key Problems of Shihezi (2013NY10) and the Special Fund for Non-profit Research Institutions of Ministry of Agriculture, P. R. China (201303115)

Identification of the Tm-22Gene by SCAR Markers in

Solanum lycopersicum

SUN Xiu-xia，YU Chao，LAI Li-li，LI Shou-ming，ZENG Yi-hui，XUE Lin

(TheVegetableResearchInstituteofShihezi，ShiheziXinjiang832000，China)

Abstract：【Objective】 This research attempts to identify Tm-22gene which is resistant to tomato mosaic virus by SCAR markers and a technical system for molecular marker-assisted breeding is intended to be established in the hope of providing a theoretical basis for disease resistant varieties breeding in Solanum lycopersicum.【Method】The SCAR markers which is tightly linked with Tm-22gene were used to amplify genome DNAs of six materials (the result of phenotype identification has been already known), using PCR amplification and Hind III enzyme to identify whether it contains Tm-22gene or not. After identification, the resistant breeding took advantage of it. 【Result】 Both resistant and susceptible materials produced 950 bp and 1,100 bp fragment. The amplified bands from susceptible and heterozygous were distinguishable after cleavage with the restriction enzyme Hind III. Genotype susceptible and heterozygous with Tm-22gene could produce respectively 1,100, 500, 300 and 150 bp and 1,100, 950, 500, 300 and 150 bp, homozygous genotypes still presented 1, 100 and 950 bp fragment.【Conclusion】According to the products which was digested by Hind Ⅲ enzyme we can make sure whether it contains Tm-22gene or not. The result of this method is obvious and reliable with low cost, not limited by time, region or growing periods, and it improves the accuracy of the selection and speeds up the breeding process.

Key words：SCAR marker; Solanum lycopersicum; Tm-22gene; molecular marker-assisted selection

通讯作者:薛琳(1964-)，男，陕西神木人，研究员，研究方向为蔬菜育种与栽培，(E-mail)xuelin1806@163.com

作者简介:孙秀霞(1985-)，女，甘肃天水人，助理研究员，硕士，研究方向为番茄遗传育种，(E-mail)sunxiuxia1983@sina.com

基金项目:国家科技支撑计划(2012BAD02B04)；兵团青年科技创新资金专项(2013CB007)；石河子农业科技攻关计划(2013NY10)；农业部公益性行业科研专项(201303115)

收稿日期：2015-05-16

中图分类号：S641.2;S188

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)02-0220-05

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.02.004