不同配比壳聚糖/聚磷酸钙复合支架应用于半月板的生物相容性研究*

齐磊同志超伍骥

不同配比壳聚糖/聚磷酸钙复合支架应用于半月板的生物相容性研究*

齐磊1同志超2伍骥3

目的评价对比不同配比壳聚糖/聚磷酸钙复合支架的体外生物相容性，观察半月板纤维软骨细胞在不同配比支架材料上的生长情况，选出最佳配比CS/CPP生物材料用于半月板的治疗。方法利用ADA将CS与CPP混合液交联，制备不同配比的CS/CPP复合支架材料。采用扫描电镜检测半月板细胞在支架材料上的生长情况。采用MTT法检测不同配比CS/CPP支架材料浸提液的毒性，通过细胞接种的方法评价支架材料的生物相容性。结果 扫描电镜下，CS/CPP复合支架材料均呈三维多孔结构；细胞在支架材料上粘性良好，分布均匀，生长良好，其中配比为3∶7CS/CPP复合支架材料上细胞粘性最好，黏附细胞数量最多。不同配比CS/CPP复合支架材料不同浓度浸提液的毒性均不高于1级，全部合格，配比为3∶7CS/CPP复合支架材料浸提液细胞相对增殖高、毒性小，细胞相容性最好，与其它配比相比，差异有统计学意义（＜0.05）。结论 不同配比壳聚糖/聚磷酸钙均具有良好的细胞相容性，其中配比为3∶7CS/CPP复合支架材料生物相容性最好，有望成为组织工程半月板的支架载体。

壳聚糖/聚磷酸钙；复合支架；半月板；细胞相容性

半月板损伤（Meniscus injury）是临床最常见的膝部关节损伤之一，半月板损伤的治疗应以修复为主而不能简单的将损伤半月板切除已成为临床共识[1,2]。受环境的影响修复后半月板不能愈合是骨科界的难题之一，为解决这一难题人们进行了许多研究。其中组织工程技术（TissueEngineering）是解决半月板修复难题最好的方法之一。应用组织生物工程技术修复半月板损伤成了目前研究的热点[3,4]。在半月板组织修复再生中支架材料是决定修复成功与否的最重要的因素之一[5]。而目前组织工程半月板支架材料还处于研究开发阶段，既往的研究表明，任何一种单一的天然或合成材料均不能够达到半月板再生结构和功能的统一[6]。于是人们开始尝试制备复合材料，以达到半月板修复的要求。壳聚糖（Chit-osan,CS）与聚磷酸钙（Calciumpolyphosphate,CPP）复合所制的复合材料可以结合二者的优点，提高生物相容性和力学强度。本文通过观察半月板纤维细胞和不同配比的 CS/ CPP支架材料的相容性，评价不同配比的CS/CPP支架材料在半月板修复中应用可行性。

1 材料与方法

1.1 设计

对比观察细胞学实验。本试验于2015年1月～6月在中国人民解放军空军总医院动物实验中心完成。

1.2 材料

实验动物：清洁级健康1周龄新西兰乳兔（由浙江大学动物实验中心提供），雌雄不限，体重约200g～300g。MTT、1∶1DMEM/F12（DF）（Sigma公司，美国）；PBS（北京中杉生物技术有限公司）；EDTA、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶（Ame rsco公司）；鼠抗兔Ⅰ型胶原单克隆抗体、鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（碧云天生物技术研究所）；碳酸钙、磷酸、高碘酸钠、海藻酸钠、壳聚糖（Millipore公司）；免疫酶标仪、CO2培养箱、离心机（Thermo公司，美国），倒置相差显微镜、扫描电镜（Olympus公司，日本）。

1.3 实验方法

1.3.1 半月板纤维细胞的分离培养

取1周龄新西兰乳兔3只，处死后在无菌操作下取双膝内外侧半月板，放入盛有少量的DF培养基的无菌培养皿中，剪成约1mm3碎块，用含1%庆大霉素的PBS冲洗3遍，先用0.25%胰蛋白酶37℃预消化30分钟，再加入0.2%Ⅱ型胶原酶37℃恒温水浴摇床振荡消化4～6小时。用巴氏吸管吹打2分钟，终止消化，用200目筛网过滤，1.2k r/min离心5分钟，弃上清，沉淀用PBS洗2次，细胞按1×106/瓶重悬于含10%FBS的DF培养基的底面积为25 cm2的培养瓶，置于37℃、5%CO2、95%湿度培养箱中培养。每3天换液1次，隔日倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。待细胞80%～90%的融合后，用含0.1%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化传代。通过细胞化学（HE染色、甲苯胺蓝、番红O）、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化对体外培养的半月板细胞进行表型鉴定，取第3代细胞进行实验。

1.3.2 壳聚糖/聚磷酸钙复合支架材料的制备

本试验设计CS与CPP的配比如下：2∶8、3∶7、4∶6、5∶5，称取相应质量的 CS、CPP，分别加入无水乙醇和醋酸溶液，加热并搅拌使混合均匀，加入交联剂 ADA溶液，1000r/min搅拌2分钟。快速将制备好的CPP/CS/ADA凝胶倒入专用模具中，-20℃冷冻4小时。然后用冷冻干燥机（压力0.5mmHg、-5℃）干燥24小时。干燥完成后，即得不同配比CS/CPP复合多孔支架材料。

1.4 复合支架材料相容性实验

1.4.1 组织工程化半月板的体外复合培养

将支架材料用去离子水超声冲洗3次，每次30分钟，60Co照射消毒备用。取生长良好的第三代半月板纤维软骨细胞，用0.1%EDTA和0.25%胰蛋白酶混合酶消化后，制备细胞悬液。4种支架材料放入96孔培养板内，用DF培养基浸泡支架1天后除去残夜，用针管将细胞悬液以0.1mL/材料样品的量从各个角度注入材料内，37℃培养箱孵育2小时后，补加一次培养基。分别在第1、3、5、7、9、11、14天取每种支架材料3份，用PBS冲洗2次后0.25%胰蛋白酶消化，使用细胞计数板计数，计算细胞粘附率和增殖情况，绘制细胞在支架上的生长曲线。

1.4.2 MTT比色法检测不同配比的支架材料对半月板纤维软骨细胞的毒性

称取制备好的质量比分别为2∶8、3∶7、4∶6、5∶5的CS/CPP复合支架材料各1.0g，分别加入试管内，60Co照射消毒。消毒后的支架材料浸入无血清 DF培养液中，于37℃、5%CO2恒温箱无菌条件下浸提72小时，取上清液为浸提液，并用PBS和DF培养液配成含10%PBS的25%、50%及100%浓度的浸提液。取生长良好的第3代半月板纤维软骨细胞，经0.1%EDTA和0.25%胰蛋白酶组成混合酶消化，接种于96孔培养板（每孔4×103个细胞，每组8孔，含空白对照2孔）。细胞在培养箱孵育12小时，待细胞贴壁后，弃去原培养基，再分别加入25%、50%及100%浓度的浸提液，并设置含10%PBS的DF培养基组作对照。培养72小时后每孔加入20 LMTT，置于37℃孵育4小时，吸去原液，每孔加入150mLDMSO，作用10分钟后在免疫酶标上于波长570nm处测定不同配比复合材料不同浓度浸提液的吸光度（A）值。计算细胞相对增殖率（Relativegrowthrate, RGR）。不同配比CS/CPP复合支架材料细胞毒性反应按照生物医学材料标准（表1）进行分级。

表1 细胞毒性反应分级标准

1.5 统计处理

采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 支架材料的复合

扫描电镜下显示4种不同配比CS/CPP复合支架材料均呈三维多孔的结构（图1）。

图1 扫描电镜下不同配比CS/CPP复合支架材料

2.2 组织工程化半月板的体外复合培养实验结果

图2为不同配比CS/CPP复合支架材料与第3代半月板细胞体外培养7天培养的扫描电镜图，从图2可知，配比为3:7CS/CPP复合支架材料上细胞粘性最好，黏附细胞数量最多，而且分布均匀，生长良好（图2）。图3为不同配比CS/CPP复合支架材料体外培养第3代半月板细胞的生长曲线，每隔24h测量一个点，每个点做3个平行样，结果取平均值。连续测量14d。从图3可知，配比为3:7CS/CPP复合支架材料细胞在支架材料细胞相容性较好，与其它配比相比，差异有统计学意义（＜0.05）。

图2 第3代半月板细胞接种到不同比例CS/CPP复合支架材料体外培养扫描电镜图

图3 不同配比CS/CPP复合支架材料体外培养第3代半月板细胞的生长曲线图

2.3 复合支架材料浸提液毒性分析

结果显示，不同配比CS/CPP复合支架材料不同浓度浸提液的毒性均不高于1级，按表1生物材料的细胞毒性评判标准，全部合格，说明各种配比的材料浸提液均没有细胞毒性，全部满足组织工程支架材料的应用要求。而配比为3∶7CS/CPP复合支架材料浸提液细胞相对增殖高、毒性小，细胞相容性最好，与其它配比相比，差异有统计学意义（＜0.05）见表2。

表2 不同配比复合支架材料不同浓度浸提液的RGR值

3 讨论

壳聚糖在组织工程方面的应用广泛，组织工程学的原理是通过种子细胞附着在生物材料的表面，形成一个具有生物活性的种植体，将该种植体植入病变部位后，生物材料降解吸收，新的组织形成时，达到修复或重建缺损组织的目的[7]。这就要求所用的生物材料不仅生物相容性好，而且要无毒、且易降解等，经研究壳聚糖完全符合上述要求，同时壳聚糖中的氨基葡萄糖基元与调控软骨细胞再生的单元结构及其相似，因此可以用作修复软骨组织损伤的支架材料[8]。聚磷酸钙是一种新型的生物陶瓷骨修复材料，强度较一般的高分子材料高，并具有良好的骨传导性，还可以刺激新骨的生长，是一种较好的骨修复材料。目前已有学者将CS与CPP复合制的复合材料，该复合材料结合了CS与CPP的优点，同时提高生物相容性和力学强度[9]，但是制备复合材料时，CS与CPP配比不同，所得复合材料的结构及相容性不同，为了制备理想的复合支架材料，本实验就CS与CPP4种不同配比哪一种能更好的提高材料的相容性进行研究。

支架材料的生物相容性是指机体与支架材料之间相互作用在生理、物理、化学方面产生复杂反应，以及机体对这些反应的耐受程度，是评价生物材料重要指标之一，是生物材料特有的基本特性。良好的生物相容性是理想支架材料必须具备的[10]，任何一种生物材料在应用之前首先应对材料的生物相容性和安全性进行评价，只有具有良好的生物相容性和安全性的支架材料才能用于临床。评价生物材料生物相容性[11]按照不同的实验层次，可分以下3方面：一是整体水平实验，优点是简单方便，易于操作，可以直观的反应宿主与生物材料的相互作用的情况；缺点是实验周期长，需要花费的人力物力大。主要实验包括：热原试验、植入试验、过敏试验等。二是细胞水平实验，主要通过观察材料对细胞的生长情况的影响来评价材料的生物相容性，实验的优点是可定量、实验便于控制、重复性好且灵敏度高等，主要方法包括：流式细胞术、MTT法、溶血试验、凝血试验等。三是分子水平实验，分子生物相容性指生物材料对细胞的DNA、RNA及细胞调控相关基因表达水平的影响，进年来，学者对于分子生物相容性的研究越来越多，主要有Westernblot、RT-PCR、Northern杂交、基因表达芯片技术等。随着医学技术的不断发展进步，对实验方法的认识不断变化，越来越多的研究者倾向于采用细胞水平实验，其中体外实验大多采用材料浸提液进行细胞培养，便于观察溶出物对于细胞生长和增殖的影响，其在评价生物相容性方面的地位已得到多数学者的认可[12]。

随着近年来组织工程技术的不断发展进步，给半月板损伤的治疗带来了新的希望，生物支架材料的制备是组织工程领域的关键因素。半月板细胞与支架材料的复合是体外构建组织工程半月板的关键技术，主要通过细胞和支架材料的双向选择评价其用于半月板组织工程的可行性。细胞－支架复合物体外培养7天时能获得最高的细胞密度，因此在本实验中将复合第3代半月板细胞体外培养7天。本实验采用二次沉淀接种法将第三代半月板纤维软骨细胞以2×107/mL种植于不同配比CS/CPP支架上，体外培养7天，该方法可以增加种子细胞沉积粘附的数量和细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM）。研究表明，壳聚糖中含有的大量自由氨基使其表面具有很强的吸附作用，有利于细胞的粘附[13]。将CS与CPP制备成复合材料，其结构上具有一种“-P-O-P-”键，该键是一种高能的仿生物活化能ATP的磷酸键，不同配比CS/ CPP复合材料中，随着CPP含量增加，半月板细胞数量和细胞外基质并不成逐渐增多的趋势，而是在配比为3∶7的CS/CPP支架材料上半月板细胞数目最多，这一结果与付维力等[14]人的结果不同，原因可能是考察的配比范围不同。本试验对兔第3代半月板细胞的毒性采用MTT法进行评价，结果显示材料浸提液对细胞增殖无影响，材料毒性判定为0～1级，0～1级为合格[15]，且当CS/CPP=3∶7时复合材料的 RGR比其他配比的高，说明当复合材料的配比为 CS/ CPP=3∶7时，复合材料的细胞相容性最好。

综上所述，三维多孔的CS/CPP复合材料能促进半月板细胞的粘附、生长，其中3∶7的CS/CPP支架材料细胞相容性和生物活性最好，最适于半月板纤维软骨细胞粘附和生长，并能促进半月板细胞增殖和维持其表型，有望成为组织工程半月板良好的支架载体。

[1]Hasan J,Fisher J,Ingham E.Current strategies in meniscalregeneration[J].J Biomed Mater Res BAppl Biomater,2014,102:619-634.

[2]Scotti C,Hirschmann MT,Antinolfi P,et al.Meniscus repairand regeneration:review on current methods and researchpotential[J]. Euro Cells Mater,2013,26:151-170.

[3]Hutchinson ID,Moran CJ,Potter HG,et al.Restoration of theMeniscus Formand Function[J].AmJ Sports Med,2014,42（4）:986-999.

[4]Brown R A.Direct Collagen-Material engineering for tissuefabrication[J].Tissue Eng Part A,2013（21）:32-38.

[5]Tan Y,Pei M.Meniscusreconstrutionthroughcoculturing meniscus cells with synovium-derived Stem on small intestine submucosa-a pilot study to engineer meniscus tissue constructs[J].Tissue Eng PartA,2010,16（1）:67-79.

[6]Myers KR,Sgaglione NA,Goodwillie AD.Meniscal scaffolds[J]. J Knee Surg,2014,27:435-442.

[7]Rongen JJ,van Tienen TG,van Bochove B,et al.Biomaterials in search of a meniscus substitute[J].Biomaterials,2014,35:3527-3540.

[8]Wang J,Fu W,Zhang D,et al.Evaluation of novel alginatedialdehyde cross-linked chitosan/calcium polyphosphatecomposite scaffolds for meniscus tissue engineering[J].Carbohydrate Polymers,2010,79:706-710.

[9]军成，霍然，吕仁荣，等.软骨组织工程中支架材料的文献回顾[J].中国组织工程研究，2012，16（3）:525-529.

[10]付维力，李箭，王践云，等.壳聚糖/聚磷酸钙复合支架的生物相容性研究[J].中国运动医学杂志，2015，34（2）:117-122.

[11]Khan SN,Cammisa FPJr,Sandhu HS,et al.The biology of bone grafting[J].JAm Acad orthop Surg,2005,13（1）:78-87.

[12]Kangjian W,Nianhua D,Shiwei X,et al.Preparation and characterization of Collagen-Chitosan-chondroitin sul-fate composite membranes[J].J Menbr Bio,2012,245（11）:707-716.

[13]Zamora DO,Natesan S,Christy R J.Constructing a collagen hydrogel for the delivery of stem cell-loaded chitosan microspheres [J].J Vis Exp,2012（64）:3624.

[14]付维力，王践云，李箭，等.半月板纤维软骨细胞与壳聚糖/聚磷酸钙体外复合培养的实验研究[J].中国运动医学杂志，2012，31: 56-59.

[15]郝和平.医疗器械生物学评价标准实施指南[M].北京：中国标准出版社，2000.

Different ratio of chitosan/poly calcium phosphate composite scaffolds used in the study of the biocompatibility of the meniscus

QiLei1,TongZhichao2,WuJi3.
1 Department of Orthopedic,Shanxi ProvinceHospital ofTCM,Xi'anShaanxi,710003; 2 Department of Orthopedic,Xi'an Red Cross Hospital,Xi'an Shanxi,10054;3 Department of Orthopedic,Air Force General Hospital,Beijing,100142,China

Objective To explore the different ratio of chitosan/poly calcium phosphate composite scaffolds correlation of cells,and its applied to study the feasibility of meniscal tissue engineering scaffold material.Methods CS CPP ADA will use amixtureofcrosslinking,prepare different ratios ofCS/CPP compositescaffolds.Usingthescaffoldgrowthscanning electron microscopy meniscal cells.Detecting toxicity of different proportions CS/CPP scaffolds extract using MTT assay to evaluate thebiocompatibility of scaffolds by cell vaccination method.Results Under the scanningelectron microscopy（sem）,CS/CPP compositescaffoldswere three-dimensional porousstructure;Cells on the scaffolds goodstickiness, uniform distribution,grow well,the ratio of 3∶7 CS/CPP composite scaffold cells on the viscosity,the best adhesion cell count most.Different ratio of CS/CPP composite scaffold material toxicity of different concentration of leaching solution are higher than that of grade 1,all qualified,the ratio of 3∶7 CS/CPPcomposite scaffold extract small relative high proliferation,cell toxicity,cell compatibility is best,compared with the other proportion,the difference was statistically significant（＜0.05）.Conclusion Different ratio of chitosan/poly calcium phosphate has good cell compatibility,the ratio of 3∶7 CS/CPP composite scaffold material biocompatibility is best,is expected to become the carrier meniscus tissue engineering scaffolds.

Chitosan/poly calcium phosphate;Composite scaffold materials;The meniscus;Cellular compatibility

R318

B

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.02.008

swgk2015-09-00180

齐磊（1978-）男，硕士，主治医师。研究方向：疼痛类疾病保守治疗，腰椎，四肢骨折，关节置换。

2015-09-17）

陕西省社发攻关资助项目（2013K12-14-02)；国家自然科学基金项目（81171741）

1陕西省中医医院骨科，陕西西安710003；2西安市红会医院骨科，陕西西安710003；3中国人民解放军空军总医院骨科，北京100142