β磷酸三钙/胶原支架材料骨组织工程研究和应用进展

丁 义，赵 刚,赵 爽

(佳木斯大学附属口腔医院正畸科,黑龙江 佳木斯 154000)



β磷酸三钙/胶原支架材料骨组织工程研究和应用进展

丁 义，赵 刚,赵 爽

(佳木斯大学附属口腔医院正畸科,黑龙江 佳木斯 154000)

骨组织工程在骨缺损修复中对支架材料的性能有很高的要求，一方面，支架材料应能防止缺损部位组织坍塌，为组织长入、新骨生成提供空间；另一方面，支架材料的骨诱导性直接影响其成骨效率，这对材料的临床应用有着极其重要的意义。β磷酸三钙/胶原复合支架具备以上两点的同时降解率较好，使新骨与支架紧密结合，进而阻止了结缔组织过度增生防止其对骨愈合效率的影响。且可塑性强，术中操作方便。该文就目前β磷酸三钙/胶原复合支架材料及其负载细胞、蛋白、基因的研究和应用做了综述，认为其作为骨组织工程的支架材料潜力巨大。

β磷酸三钙;胶原;骨组织工程

骨缺损的修复途径之一即采用骨组织工程技术，利用各种性能良好的支架材料高效诱导新骨的形成。β磷酸三钙/胶原支架材料(β-TCP/Col)从仿生学的角度出发,模拟了骨组织的有机和无机成分,尤为重要的是,两种材料复合后,胶原材料因为与β磷酸三钙良好的生物活性和骨传导性结合而使复合物具备了骨诱导性,而且这种支架材料创造了一种适合人类细胞生长的三维环境[1]。Zou[2]利用扫描电镜观察到β磷酸三钙与胶原纤维紧密结合，复合物细胞毒性经MTT法检测与对照组无统计学差异，在动物实验中，12周时完成骨组织再生。随着对支架材料研究手段的不断完善，β磷酸三钙/胶原复合材料各种形式的应用屡屡见诸报道。我们从单纯支架材料、与种子细胞复合培养、添加生长因子3个方面对目前该材料的研究进展做一综述。

1 单纯支架材料

刘星纲[3]将β-TCP/Col复合物植入5月龄新西兰大白兔下颌骨下缘箱型缺损中，12周时实验侧骨质完全愈合，与周围骨质界限不明显，仅表面骨皮质较周围骨质欠光滑。Zheng[4]研究了β-TCP/Col复合物作为兔股骨远端孔状缺损模型充填物的生物相容性，在兔股骨两端制备直径6 mm深10 mm的极限缺损，其中一孔充填实验材料，另一个作空白对照，1、3、6个月后处死实验动物做骨愈合程度分析，实验组使用β-TCP复合物，新骨生成的质与量显著优于空白组。Eiji[5]利用该材料充填直径5 mm的大鼠颅骨缺损,术后6周，实验组可见不成熟的骨结构伴致密结缔组织；12周时，支架材料完全由致密、连续、成熟的骨组织替代。

牙齿缺失后行种植修复是目前较为先进的一种修复方式，但牙齿缺失后局部解剖关系的改变导致的骨量不足及牙槽骨不断吸收所致的牙槽骨宽度和高度的降低均会影响种植修复效果[6]，因此，对牙槽骨缺损修复的研究越来越多。Takahashi[7]拔除13条比格犬上颌第2、3前磨牙，制备5 mm×3 mm×7 mm的骨缺损，缺损位置由β-TCP/Col、β-TCP、Col充填或不充填，术后4周，β-TCP颗粒留存在骨缺损处，β-TCP/Col和β-TCP组骨生成活跃，胶原组和空白组缺损处结缔组织长入，在β-TCP/col和β-TCP组，可见保存完好的牙槽嵴；8周时，大多数β-TCP颗粒吸收，只少量剩余。Brkovic[8]在人拔牙创愈合中使用含胶原膜或不含胶原膜的β-TCP/Col复合物，9个月后进行临床检查，无膜组牙槽嵴显著降低；利用组织形态学、免疫组织化学对活检样本进行分析，新骨生成区域比例无明显差异(分别为42.4%和45.3%)，骨粘连蛋白表达均有增强，生成足量活力骨。

2 与种子细胞复合培养

钟金晟[9]完整拔除1.5岁雄性比格犬获得犬牙周膜细胞，在多孔β-TCP/Col支架上贴附生长。扫描电镜观察显示，较多的犬牙周膜细胞贴附材料表面，细胞生长旺盛，排列紧密。细胞伸展充分，呈星形或梭形,表面有绒毛状结构,周围可见较多细长突起,与材料及周围细胞紧密相连。细胞表面可见明显的纤维状和颗粒状基质分泌物。目前普遍认为异位成骨能力是初步评判材料是否具有成骨活性的重要指标[10]。许卫兵[11]观察骨髓基质干细胞与β磷酸三钙体外复合培养1周后自体回植兔肌肉内异位成骨的效果，4周时可见新生骨样基质；8周后新生骨量明显增多，可见典型的骨组织结构，为复合物负载种子细胞的研究奠定了基础。陈竹生[12]制备纳米β磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架-犬骨髓间充质干细胞复合物，植入普通级12月龄杂种犬膝关节软骨缺损模型：第12周，实验组分布白色半透明组织，软骨细胞分布较均一；第24周，实验组分布白色半透明新生软骨组织，色泽与正常软骨相似，质韧，表面平整，与正常软骨界限消失。刘星纲[13]将新西兰大白兔骨髓间充质干细胞与β-TCP/Col支架材料复合培养3 d，自体回植，10周时，骨外形比对照侧丰满，与周围正常骨质外形相似；而对照侧尚有许多索条状新生骨，外形与周围骨质差别明显，处于骨改建过程中。

Todo,Arahira[14-15]将兔骨髓间充质干细胞在β-TCP/col支架上培养28 d评估随时间进展胞外基质生成的变化和支架-细胞系统机械性能的表现，评估弹性模量，β-TCP组的细胞数和ALP活性较单纯胶原组较强，复合支架组成骨基因表达和I型胶原生成量明显高于另一组，弹性模量在d 28增加了。其在随后的研究中通过扫描电镜观察支架微观结构的变化，将弹性模量与生物性能微观结构相联系解释肉眼可见的材料弹性的多种变化机制。实验表明，在第一阶段由于细胞的增殖和之后网状结构的形成，复合支架模量趋于升高；第二阶段，由于材料的降解(例如胶原的塑性形变和β-TCP的分解)对性能的影响大于胞外基质的生成，所以模量趋于降低；第三阶段，矿化结节的形成和生长引起的活跃钙化导致模量的恢复。

3 添加生长因子

组织工程学技术修复骨缺损正在由传统的单一材料到复合材料转变，细胞因子、载药缓释系统等载入到复合材料中，为加快修复骨缺损提供了良好的动物实验依据[16]。临床前研究和临床研究已经证明骨形态发生蛋白2(BMP-2)能够应用于多种治疗干预，例如骨缺损、不规则骨折、脊柱融合、骨质疏松和根管手术等[17]。李想[18]将重组人骨形态发生蛋白(rhBMP-2)复合到两种材料上植入大鼠皮下观察异位成骨的情况，证实了加入rhBMP-2蛋白的两实验组表现更高的组织骨密度和骨小梁厚度。Martínez-Sanz[19]通过注射BMP-2蛋白给两种不同载体实现上腭黏膜下的成骨诱导。7只加入rhBMP-2蛋白和β-TCP生物材料，6只加入rhBMP-2蛋白和胶原凝胶，加入量为5～10 μL，位置是2～3腭皱之间右侧腭黏膜，对侧做空白对照，6周后，未见编织骨等新骨，实验侧可见黏膜厚度增加。实验侧骨调素、增生细胞核抗原的免疫标记反应、末端标记法均显示强烈的成骨诱导，同一样本对照侧无此变化。Cristiane Ibanhes[20]将rhBMP-2蛋白负载在多种骨代物上用于兔颅骨垂直引导性骨再生，证实了添加rhBMP-2蛋白促进组织生长平均体积，表现为生成更多薄片状骨，同时更多骨代物的降解。

Lee[21]将rhBMP-2负载于β磷酸三钙上，实验发现ALP的活性及表达在全β磷酸三钙颗粒组显著增加。在SD大鼠颅骨缺损模型中，术后4、8周CT及组织学检测，载rhBMP-2蛋白的TCP和载rhBMP-2蛋白的TCP/HA(80%/20%)组充满新骨且骨体积和小梁数均高于未载rhBMP-2蛋白各组，证实了β磷酸三钙可用作rhBMP-2蛋白的载体。

Tobias[22]构建β磷酸三钙和Ⅰ、Ⅱ型胶原的双层结构修复gottingen小型猪的两条后腿膝关节中的髌骨槽内侧小面上的骨软骨临界性缺损。实验分3组，第一组为空白对照组，缺损处不充填任何物质(自体愈合，n=12)；第二组充填该双层结构(n=12)；第三组，双层结构基础上添加生长因子混合物(BMP-2,3,4,6,7和转化生长因子1，2，3)(n=12)，术后第6、12、52周对缺损的再生情况进行评估，通过光学显微镜、荧光显微镜和X射线显微照相术等手段对缺损再生和移植物吸收进行定性和定量的组织形态学检测，临界骨缺损始终没有发生自愈,第一组52周的骨形成率最高只有(21.84±2.81)%；双层结构充填后新骨形成较空白对照组明显增多，6周时(29.8±9.68)%，12周时(40.09±4.76)%,52周时β磷酸三钙几乎完全降解(4.35±3.70)%，缺损部位由薄层状的骨小梁充满;第三组β磷酸三钙吸收更早、骨再生更快。

4 小结与展望

刘星纲、Zheng、Eiji分别将支架材料应用于兔下颌骨下缘箱型缺损、兔股骨孔状缺损和大鼠颅骨缺损，实现了不同部位、不同形状的骨缺损的修复，反映了β磷酸三钙/胶原复合物生物相容性、骨诱导性高，适合多种类型的骨组织修复；其易于塑形，术中操作方便，可塑性好。Kishore[23]选择双侧牙周骨下缺损患者的20个部位作为研究对象，比较β-TCP添加可吸收I型胶原膜与否对其再生潜力的影响。0、6周及3、6、9个月分别测定菌斑指数、牙周指数、牙周袋深度、附着水平和牙龈退缩，结果显示，两组各项指标均有改善，单纯移植物和膜都显示出了理想的实验结果。但将β-TCP和I型胶原联合使用并不能有统计学角度的疗效增强。

钟金晟观察到犬牙周膜细胞在支架材料表面伸展充分，与支架、细胞紧密相连且分泌基质。Zhang[24]观察到大鼠牙胚细胞与滴加rhBMP-2蛋白的支架材料复合培养后，形成典型的牙样结构，同时形成几率明显较大，为β磷酸三钙/胶原支架材料在牙组织工程的应用奠定了基础，两个实验的结果为后续负载种子细胞提供了依据。同时，Zhang的研究实现了生长因子与种子细胞同时参与支架材料的改性。

关于生长因子的选择，生长因子混合物的添加加速了β磷酸三钙层的吸收，但不能促进新骨生成。

支架材料负载目的基因修饰的种子细胞是基因工程与骨组织工程结合的重要成果。Kaige[25]在修饰种子细胞时利用非病毒载体GenEscortTM基因转染效率高达(36.67±4.12)%，得出了其介导的BMP-2基因转染可以作为基因修饰骨组织工程的一种安全有效的非病毒转染途径。而宁寅宽[26]利用的则是重组腺病毒作为载体，成功对骨髓间充质干细胞进行了基因修饰，修饰后的细胞高效表达了目的基因。李娟[27]制备纳米级多孔β磷酸三钙/胶原支架，并负载BMP-2质粒DNA形成基因修饰的支架材料，成功修复大鼠颅骨顶部骨缺损。两种载体的成功运用，选择的质粒DNA浓度为以后研究提供了实验参数和依据。目前采用基因工程联合骨组织工程可以有效防止细胞老化，并且能使细胞长期有效地表达生长因子[28]。第三代支架的发展趋势是其应具有成血管化和成骨诱导性。血管化和骨组织再生是骨愈合过程中的2个最基本环节，体外构建的组织工程化骨植入体内后必须迅速建立充分的血供为种子细胞提供充足营养[29]。

综上，单纯β磷酸三钙/胶原支架材料已经用于临床研究，更多的人体内研究将会开展，通过细胞、生长因子对β磷酸三钙/胶原支架材料进行改性，一方面可以检验支架材料对不同细胞的生物相容性，拓宽其应用领域；另一方面，可以不断调整支架材料降解速度与新骨生成速度，使之同步，进而提高成骨效率并加快愈合，发展前景广阔。而利用基因工程手段实现细胞表达水平的改变的研究较少，随着学科交叉的深入发展，相信会成为研究的前沿。

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[责任编辑：李蓟龙]

丁义(1990-)，男，河北张家口人，硕士研究生在读。

R 318.08

C

10.3969/j.issn.1673-1492.2016.10.020

来稿日期：2016-04-13