阻抗型免疫传感器的发展与应用

金　晶，李群芳，张升晖（湖北民族学院化学与环境工程学院，湖北恩施445000）



阻抗型免疫传感器的发展与应用

金晶，李群芳*，张升晖*
（湖北民族学院化学与环境工程学院，湖北恩施445000）

摘要：阻抗型免疫传感器是利用抗原（或抗体）在电极表面发生特异性结合前后导致电极表面的电化学性质发生改变而实现对抗体（或抗原）进行测定一类新型免疫传感器，其具有制备简单、响应时间短和灵敏度高等特点。该文对阻抗型免疫传感器的工作原理，发展及现阶段的应用进行了综述，并对未来的发展趋势进行了展望。

关键词：阻抗型免疫传感器；生物分子；分析检测

0　引言

免疫传感器是将免疫检测技术与高灵敏的传感技术相结合而产生的一类新型生物传感器。电化学免疫传感器是免疫传感器中研究最早、种类最多，也较为成熟的一个分支，它有效结合了各种电分析技术（如脉冲伏安法、溶出伏安法、交流阻抗谱图法等），使灵敏度得到了大大的提高，在短短几十年里相继开辟了种类繁多的研究和应用领域，目前正朝着更加灵敏、高效、微型和适用的方向发展。其通常是由三部分组成分别为：识别元件、换能器及相应电路，并将电化学的高度灵敏的特性与免疫复合物之间的特异性反应联系在一起，从而对目标待测物进行分析，具有制备简单，响应灵敏，对目标物质的检测速度快的优点，且有良好的选择性和稳定性，克服了传统检测方法的诸多缺点。随着免疫传感器的不断发展，免疫传感器的应用越来越多，类型越来越丰富，根据检测所用到的分析技术的不同，按照工作原理可被分为电位型，电流型，电导型，电容型和电阻型，而其中阻抗型免疫传感器是通过研究电极界面电子传递能力的变化来对待测物进行分析的一种检测手段，不仅具备上述电化学免疫传感器的共同特性，还具有高通量，无标记的特点［1-7］。该文将对阻抗型免疫传感器在各领域的应用进行综述，并对其发展进行评述。

1　阻抗型免疫传感器的原理

阻抗型免疫传感器是采用了交流阻抗法（EIS）通过测定免疫复合物或酶与底物在电极表面发生特异性的结合或反应而引起电极表面阻抗值的变化值来对目标物进行测定，交流阻抗法是以不同频率的小幅值正弦电压为扰动信号，随着时间的变化所引起电流与微扰信号之间呈现出线性关系而得到电极阻抗，阻抗（Z）的定义为V（t）/I（t）［8］，而把每个动力学的过程都用电化学电池中的组件表示，可以推测电极的等效电路，其中包括电阻，电感和电容，可用于分析电极系统所包含的动力学过程及其机理。而阻抗型免疫传感器主要是对等效电路中电阻值的检测，通过交流阻抗谱图可以直接得到阻抗值，阻抗曲线包含两个部分：一个半圆部分和一个线性部分。半圆直径在更高频率对应的是电荷转移电阻（Rct），线性部分在较低频率对应于扩散的过程［9-11］。通常交流阻抗法作为一个强有力的表征手段用于检测电极制备过程电极表面的电化学性质，在对生物小分子及有害物质检测的应用也非常广泛。

2　阻抗型免疫传感器的应用

2.1临床检测

2.1.1肿瘤标志物的检测

肿瘤标志物是在1978年由Herberman提出，是反映肿瘤存在的一类化学物质，目前发现的肿瘤标志物有一百多种，而常用的只有二十多种［12］，其在人体内的存在与浓度的量变都可能暗示着某种肿瘤的产生，在临床检测中常常被用来了解肿瘤组织的细胞分化及细胞功能，而达到对肿瘤进行早期诊断及治疗指导。目前免疫传感器在肿瘤标志物检测的相关报道有很多，常见的目标检测物有癌胚抗原（CEA），甲胎蛋白（AFP），前列腺特异性抗原（PSA）等。Tang等［13］合成的尺寸为15±1.5 nm的纳米金颗粒表面自组装单层谷胱甘肽用于固定癌胚抗原的抗体（anti-CEA）并与邻氨基苯酚通过CV的方法共聚合在电极表面，随着抗原抗体免疫复合物的形成，CEA浓度在0.5～20 ng/mL时，与阻抗值呈正相关。Zhou等［14］将金电极置于1，6-己二硫醇中，通过Au-s键在金电极表面进行组装，然后置于纳米金胶体中使得电极表面生成纳米金颗粒，纳米金颗粒可以与葡萄球菌A蛋白结合，最后用葡萄球菌A来固定anti-CEA，对CEA进行测定，在浓度范围为0.001～100 ng/mL时，浓度的对数值与阻抗值成正比，检测限为达到0.0001 ng/mL。王丽娟等［15］制备的纳米金/壳聚糖/石墨烯修饰玻碳电极形成的阻抗型免疫传感器测定CEA，实验利用了纳米金良好的生物相容性固定抗体以氧化石墨烯良好的导电能力，制得的传感器具有良好的响应，得到线性范围为0.1～85 ng/mL。AFP作为肝癌的标志物，一般情况下采用抗体与抗原特异性结合来完成对抗原的检测，Yang等［16］建立了以麦胚凝集素作为分子识别元件识别AFP，羧基功能化的碳纳米管可以与麦胚凝集素以共价键的形式在丝网印刷碳电极的表面结合，而随着AFP的浓度增加，电极的电子转移电阻增加，并与浓度的对数值有一个良好的线性，提供了一个检测AFP的简单灵敏的新方法。Kavosi等［17］分别用差分脉冲伏安法（DPV）和交流阻抗法（EIS）对PSA进行检测，同时建立了夹心型电流免疫传感器和无信标的阻抗型免疫传感器，并可以应用于对血液中实际样品的检测，检测限分别为10 fg/mL和5 pg/mL。阻抗型免疫传感器一般情况下会用Fe （CN）63-/4-作为氧化还原介质，而Li等［18］用4-氯奈-1-萘酚（4-CN）作为氧化还原介质，抗体和DNA酶功能化的金钯纳米复合材料进行结合形成Ab2-AuPd-DNA作为信号放大的标记物，4-CN可以被DNA酶催化氧化形成不溶的物质附着在电极表面，从而降低电极传递电子的能力，并与PSA的浓度呈正相关。当胃癌、乳腺癌、膀胱癌或头颈部鳞癌的存在时表皮生长因子受体（EGFR）表达就会急剧增加，Elshafey等［19］在电极表面镀一层纳米金以扩大电极的比表面积，并用蛋白质G作为支架用于固定 EGFR抗体，对EGFR进行检测，并且在PBS中的检测限为0.34 pg/mL，而在人类血浆中得到的检测限达到了0.88 pg/mL。Arkan等［20］则是通过制备金纳米粒子/多壁碳纳米管-离子液体电极对人表皮生长因子受体2进行测定，实验用纳米金来增强电极对抗体的固定能力，电极有一个很好的响应，检测范围为10～110 ng/mL，并有一个较低的检测限7.4 ng/mL。CA125可用作卵巢癌的诊断和预防，Raghav等［21］合成了金核壳银型的纳米材料直接用于固定抗体用于检测CA125，线性范围1～150 IU/mL。2.1.2其他疾病标志物的检测

葡萄糖是人体生命活动不可缺少的物质，是人体新陈代谢的主要来源，而当人体内胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用有障碍时就会患糖尿病，其为以高血糖为特征的代谢性疾病，而对糖尿病患者来说，血糖是诊断糖尿病的唯一标准。目前葡萄糖的免疫传感器非常多，Shervedani等［22］利用黄金巯基丙酸在金电极表面进行自组装，用于固定葡萄糖氧化酶，并用对苯醌作为氧化还原介质，其会被还原为邻苯二酚，利用葡萄糖在电极表面氧化会使得邻苯二酚的扩散电流增加，而表现出随葡萄糖浓度的增加会有一个减小的阻抗值，并与阻抗的倒数值呈良好的线性关系，第一次实现了使用感应电流的阻抗传感器对葡萄糖进行测定。卵巢基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在神经炎症硬化病理过程中起着至关重要的作用，为多发性硬化症的外围神经炎症的生物标志物，Biela等［23］在互相交叉金电极表面自主装一层半胱氨酸，结合氧化葡聚糖后，在表面滴加肽链使其充分的交联，然后加入MMP-9使肽链链断开，用阻抗法进行监测，△Z%随其浓度增加而增加，得到一个可应用于临床检测的线性范围为50～400 ng/mL。免疫球蛋白G（（IgG）是人体血清中的主要抗体成分，大约占血清蛋白的75%左右，可以对病毒、病菌进行防御，在人体中起到保护作用。其浓度的升高和降低都暗示着一些疾病的发生，如结缔组织病、肝脏病、传染病、免疫缺陷综合征，某些白血病等，故对其进行快速灵敏的检测是很有必要的。目前对IgG检测的方法有很多种，其中用免疫传感器对其进行检测的报道也很多。Zhang等［24］建立了一个简单的阻抗型免疫传感器，将一定量的吡啶甲醛与聚环氧氯丙烷在DMF中混合，并在氩气的保护下120℃时反应，得到带有醛基的聚合物，直接滴涂在电极表面与反IgG抗体进行结合，当IgG滴加到电极表面时会使得电极表面传递电子能力降低，从而对IgG进行检测。Tabrizia等［25］则利用了过氧化聚吡咯修饰金纳米颗粒对Fe（CN）63-/4-有良好的磁导率，用其修饰丝网印刷电极，用EIS对人免疫球蛋白G进行检测。人血清（HSA）可以反映肝脏合成功能和肾病造成的蛋白丢失的情况，同时可能暗示着一些疾病的产生，Arkan等［26］首先在离子液体-多壁碳纳米管的表面电沉积一层纳米金修饰电极，然后纳米金胶是通过1，6-己二硫醇上的巯基结合到电极表面用于固定anti-HAS，有HAS存在时电极的阻抗值升高，并与浓度呈良好的线性关系，线性范围和检测限分别为0.1～100 μg/mL，15.4 ng/mL，可以用于人类尿液和血清样本中对HAS的检测，对蛋白尿和糖尿病患者进行诊断。

2.2病菌的检测

病菌为引起人类疾病的细菌，寄生于生命体中，病菌按照尺寸的大小可以分为细菌和病毒，细菌长约一微米，病毒是最小的病菌。病菌可以引起很多的传染病，在病菌发现初期，中国就出现了天花的相关记录，而到如今的非典，甲流，禽流感等一些病菌所引起的疾病越来越普遍。所以对病菌的检测非常重要。Lin等［27］建立了一种简单灵敏低成本的快速检测禽流感（Al）H5N1的阻抗型免疫传感器，分析了鸡在一个小时以内分泌物中Al H5N1的含量并证明病毒的存在，相应的抗体特定单克隆抗体AI H5N1病毒是由小鼠骨髓瘤细胞融合脾淋巴细胞与H5N1病毒免疫产生，得到的检测范围为2-1～24HAU/50 μL，并且电极有很好的抗干扰性。鼠伤寒沙门氏菌是引起急性胃肠炎的主要病原菌，一般通过食品和饮料进入到人体，每年的发病率也相对较高，Dong等［28］将制备的聚酰胺-多壁碳纳米管-壳聚糖纳米复合材料用于修饰玻碳电极，结合纳米金用于固定鼠伤寒沙门氏菌抗体，用于检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的含量，阻抗值与其浓度在1.0×103～1.0×107CFU/mL之间时有一个良好的线性关系，得到检测限为5.0×102CFU/mL。Nguyen等［29］用磁性二氧化硅纳米管（MSNTs）固定抗体和互相交叉微电极建立了对鼠伤寒沙门氏菌进行测定的阻抗型免疫传感器，MSNTs极大的增加了传感器的信号使得不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌之间的阻抗值有很明显的差别，整个测量过程大约30 min左右且低成本和方便操作，可用于实际样品中的检测。Joung等［30］使用氧化铝纳米多孔膜和透明质酸 （HA）有效地减少生物分子和其他细胞的非特异性结合，并能很好的固定抗体，建立了一个简单的和快速的检测方法用于牛奶中大肠杆菌的测定。霍乱弧菌可以引起一种烈性肠道传染病，一般发病急，死亡率也很高，Tam等［31］以氧化铈纳米线作为点滴材料，通过乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐形成氨基酸酯将O1群霍乱弧菌抗体固定在氧化铈纳米线表面，当加入不同浓度的O1群霍乱弧菌时，电极表面的阻抗值发生变化，阻抗值与浓度有一个很好的线性关系，得到一个低的检测限1.0×102CFU/mL。

2.3食品中的应用

日常生活饮食与人类身体的健康是正相关的，而目前随着生活节奏的日益增长，速食品越来越多，食品安全问题一直备受关注，人们所接触到的食品中有很多对人体有害的物质，除了上述的病毒病菌会存在于食品中，还有各种霉菌素，农残，添加剂等，这些都会给人体健康带来伤害，而对这些物质快速有效的检测是很有必要的。黄曲霉毒素B1（AFB1）是一个丰富毒素存在于橄榄及其衍生物中，一直和人类肝细胞癌的病因脱不了干系，Yu等［32］将羧基化切短的碳纳米管加入到离子液体中用玛瑙研钵打磨30 min，离心后取沉淀，并加入抗体，形成了碳纳米管/离子液体/抗体滴涂到电极表面，碳纳米管良好的导电性能和离子液体能为抗体提供了一个良好的微环境，二者共同作用提高了电极测定AFB1的灵敏度。检测范围为0.1～10 ng/mL，可以用于各种农产品和植物油中AFB1的检测。Dan等［33］应用了还原的氧化石墨烯与聚吡咯 （PPy）和吡咯丙基酸（PPa）结合形成一个独特的传感平台用于检测AFB1，PPy的加入提供了探针固定共价链接器，PPa的掺杂赋予了膜的电化学活性从而大大促进了阻抗型免疫传感器检测的灵敏度，实验得到了一个宽的检测范围。呋喃丹是一种氨基甲酸酯类杀虫剂，主要是通过蔬菜瓜果进入到人体内，主要抑制体内胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱在组织中蓄积而引起中毒。Liu等［34］制备了一种简单快速检测呋喃丹的阻抗型免疫传感器，用L-半胱氨酸修饰电极，戊二醛作为固定抗体的交联剂，在优化的条件下，阻抗的变化与呋喃丹的浓度的对数值正相关，所能检测的浓度范围为1.0×10-1～1.0×103ng/mL，可应用于监测呋喃丹在农业和环境样品的残留。

3　结论与展望

目前阻抗型免疫传感器的应用已经涉及到临床检测、细菌病毒检测、食品环境、非法药品［35-36］、气体［37］等等，这是由于阻抗型免疫传感器具有小型化，制备简单，反应灵敏且不需要加入酶标就可以对待测物直接进行检测，但阻抗型免疫传感器的灵敏度，检测范围和检测限一般都会比电流型免疫传感器高很多，导致其应用并没有电流型免疫传感器广泛，故进一步提高阻抗型免疫传感器的检测灵敏度一直倍受研究人员的关注。未来在构建阻抗型免疫传感器将会延续制备简单无酶标的特点，致力于研究新的纳米材料提高电极传导电子的能力，提高传感器的灵敏度，更广泛的应用于各个领域，同时要考虑传感器的制备成本，保证低成本，高稳定性和使用寿命。相信随着不断地发展阻抗型免疫传感器的性能会越来越好，并能做到更加高效、更加快速、更加灵敏地应用到各领域的检测中。

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*通信联系人，E-mail:slindar809@126.com，Tel:0718-8437531

Development and application of electrochemical impedance spectroscopy immunosensor

Jin Jing，Li Qun-fang*，Zhang Sheng-hui*
（College of Chemical and Environmental Engineering，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China）

Abstract:Electrochemical impedance spectroscopy immunosensor was based on the specific binding between biological molecules on the electrode surface to change the electrochemical properties of the electrode，so as to determination of biological molecules，which possesses simple preparation，short response time and high sensitivity characteristics.The working principle，current development and application of the electrochemical impedance spectroscopy immunosensor are summarized in this review，and the latest technological challenges and future development trend is prospected.

Key words:electrochemical impedance spectroscopy immunosensor；biological molecules；analysis detection