细胞培养技术方法及避免污染的措施

孙伟（吉林省五星动物保健药厂，吉林　长春　130062）

细胞培养技术方法及避免污染的措施

孙伟（吉林省五星动物保健药厂，吉林长春130062）

医学研究中最具技术含量的研究手段就是细胞培养，同时它还是生物学研究中应用比较广泛的一种方法。下面本文就细胞培养技术方法进行分析，观察其操作中引发污染的情况，同时提出几点避免污染的措施，内容如下。

细胞培养技术；污染；措施

1　细胞培养技术方法分析

1.1细胞原代培养技术

细胞的原代培养是指取样完成后的第一次培养实验，它能够在细胞分化、药物测试或病毒试验等方面取得显著培养效果。其技术的应用首先先对提取的样品组织进行清洗，然后将其切成较小组织块，可在1或2mm，再给予分散剂扩大组织块，时间1小时或半小时，之后进行吹打，并在混匀后利用过滤网滤过，将细胞与细胞团离心出来，放在对应浓度的培养基上，调整好培养箱，温度在37摄氏度，二氧化碳在5%，将培养基置于培养箱中开始培养实验，此技术的试验成功率很高。

1.2细胞传代培养技术

传代培养的应用是在离体细胞生长一定时间后，当其发生分裂且增殖逐渐缓慢或要终止生长死亡前，从一个培养瓶按一定比率转移到另一个培养瓶内继续培养和生殖的方法，这种方法被称作传代培养技术。此技术的应用首先将原旧培养液吸出，取PBS缓冲液对其进行两次冲洗，然后取胰蛋白酶液滴入其中给予消化处理，之后利用显微镜进行查看，待细胞恢复饱满样时，将胰酶液吸出后再将新鲜血清培养基加入到瓶中，避免细胞粘壁进行吹打，并将其分装于培养瓶中培养，保证培养液充分并使细胞均匀浮于上面，之后加强观察，一旦又出现细胞分裂到一定程度时再给予传代培养。

1.3细胞冻存技术

细胞的冻存可以有效保证细胞活性和长期保存，一般在～80摄氏度的冷存环境下细胞可储存一年的时间，若在液氮环境下，～196摄氏度中能够长期保存，直至使用，也有相关学者表明，长期保存的牙髓成纤维细胞，其使用率及成活率在80%以上。这种冻存技术的操作中，在细胞冻存前应该先对对数细胞进行培养液培养，然后将其去除，再投入消化液、离心，离心后将上清液去除，加入冻存液，待细胞密度适度调整以后，取悬液细胞并分别装在冻存管中，封闭，明确写明细胞名称、代数、冻存时间等，先于4摄氏度存放半小时，再移入～20摄氏度冷箱内冻一小时，之后放在～80摄氏度冻箱内冻存24小时，最后可置于电子技术控制的冰冻箱中长久存储。

1.4细胞的复苏技术

细胞复苏技术的应用主要是对冻存细胞进行复苏，促使其恢复活性，当冻存管从液氮环境中取出后，马上放入准备好的37摄氏度水环境中进行快速、反复晃动，晃致冻存液彻底融化为止，然后将融化后的细胞置入离心管内，取4ml培养液渐渐滴入其中，用每分钟1000转速度离心，然后在细胞沉淀以后进行密度调整，再行细胞培养。

2　细胞培养中引起污染产生的原因

2.1微生物

微生物在生活环境中是无处不在的，无论是静止物体，还是人们皮肤表层、动物皮毛等，其表面均存在细菌。而在实验室进行细胞培养时，如果工作人员对微生物学及相关技术不了解或没有经过严格培训，其操作中会忽视很多细节，造成微生物污染，如细胞培养使用的培养基、器皿、使用设施、从一处转移另一处时等，这些操作若不能有效避免，严格无菌操作，或在切割时不遵从无菌切开等，均可产生微生物污染。

2.2工作人员

人体是在不断活动的，在实验室内工作人员是产生污染的最大来源，细胞培养各种操作都需要工作人员进行，其皮肤鳞屑、活动中带动空气或说话时飞沫与口腔内存在的多种微生物等，均可对细胞培养造成污染威胁，而且一旦工作人员携带病菌或感染病毒，进入实验室就是一个高危污染源。同时实验室的通风口、棚板口、排水口等各种通道也存在不断产生新污染的危害，像一些水槽、潮湿培养箱等潮湿地方也存在滋生细菌并提供污染的危险。

2.3试剂

细胞培养中试剂的使用同样存在一定潜在污染概率，购进的试剂及培养基具体的应用要明确，它们有无细菌，具体作用及有无必要进行灭菌等。就如生长因子或血清在培养试验中，易发生病毒污染，所以说有的试剂原材料购进时未灭菌，而有的培养基，如猪胰蛋白酶，它含有动物病毒，试验中会导致细胞培养结果的不准确，因此需要对试剂进行风险评估，确定其使用的可靠，减低试剂使用不当引起的污染。

3　避免污染的措施

3.1工作人员和环境

工作人员进实验室行细胞培养前必须彻底对手、手臂清洁和消毒，穿戴一次性胶手套、无菌外衣、鞋，扎好袖口；细胞培养前将各种用具放于无菌照射下灭菌30min；各操作必须按照无菌操作流程进行；同时细胞培养试验台与培养储存柜、清洁区等要保持较远距离；定期对潮湿区域检测，及时给予处理，防止产生污染。

3.2细胞培养的用品和试剂

细胞培养中涉及的各种如试管、过滤器等用品，使用前均进行酒精喷擦，酒精度80%；使用的一次性无菌塑料用品开封后必须单独存放；试验中试剂瓶打开后，将盖口向下置于无菌台上，关盖前必须用酒精灯烤后在盖严；试剂的选购严格检验生产日期、批次等，对一些没有灭菌的试剂进行评估确定后再使用等。

［1］周丽薇.细胞培养技术与防止细胞污染的方法［J］.医学信息（上旬刊）.2010（11）.

［2］姜彬.细胞培养技术简介及避免污染的策略［J］.生物学通报.2008（03）.

［3］史嘉林；杨栋.细胞培养及避免细胞污染的方法［J］.养殖技术顾问.2010（07）.

［4］马艳南；阎雪莹；殷悦；蔡丽杰.细胞培养技术及避免污染的方法［J］.黑龙江科技信息.2014（29）.